Sterilisasi tip pipet lan tabung EP, lsp.

1. Siapke 0,1% (sepersewu) DEPC (zat sing beracun banget) karo banyu deionisasi, gunakake kanthi ati-ati ing hood fume, lan simpen ing 4 ° C adoh saka cahya;

Banyu DEPC yaiku banyu murni sing diolah nganggo DEPC lan disterilisasi kanthi suhu dhuwur lan tekanan dhuwur.Diuji bebas saka RNase, DNase lan proteinase.

2. Sijine tip pipette lan tabung EP menyang 0,1% DEPC, lan mesthekake yen tip pipette lan tabung EP kapenuhan 0,1% DEP.

3. Nglindhungi saka cahya, ayo ngadeg, sewengi (12-24h)

4. Kothak sing ngemot tip lan tabung EP ora perlu direndhem ing DEPC.Sawise kira-kira mbusak banyu DEPC ing tip utawa tabung EP, bungkus lan bungkus.

5. 121 derajat Celsius, 30 menit

6. 180 derajat Celsius, garing nganti pirang-pirang jam (paling ora 3 jam)

Cathetan: a.Nganggo sarung tangan lan topeng lateks nalika nangani DEPC!b, utawa tanpa sterilisasi DEPC, 130 ℃, 90min autoclave (akeh laboratorium sterilisasi suhu dhuwur kaping pindho)

Pertimbangan ekstraksi RNA

Loro fenomena utama kegagalan isolasi RNA jaringan

Degradasi RNA lan residu impurities ing jaringan,babagan degradasi, ayo dideleng dhisik kenapa RNA sing diekstrak saka sel kultur ora gampang rusak.Reagen ekstraksi RNA sing ana kabeh ngemot komponen sing nyandhet RNase kanthi cepet.Tambah lysate menyang sel kultur, lan mung nyampur, kabeh sel bisa dicampur sak tenane karo lysate, lan sel rampung lysed.Sawise sel kasebut dilisis, bahan aktif ing lisat langsung nyandhet RNase intraselular, saengga RNA tetep utuh.Tegese, amarga sel sing dibudidaya gampang lan kontak lengkap karo lysate, RNA ora gampang rusak;ing tangan liyane, RNA ing jaringan gampang rusak amarga sel ing jaringan ora gampang kontak lysate kanthi cepet.amarga kontak cukup.Dadi,yen ana cara kanggo ngowahi jaringan dadi sel siji nalika nyandhet aktivitas RNA, masalah degradasi bisa rampung rampung.

Penggilingan nitrogen cair minangka cara sing paling efektif.Nanging, cara panggilingan nitrogen Cairan banget troublesome, utamané nalika nomer conto akeh.Iki nyebabake sing paling apik sabanjure: homogenizer.Inghomogenizercara ora nimbang pitakonan saka carane aktivitas RNase nyandhet sadurunge sel sing kontak karo lysate ing, nanging ndedonga sing tingkat gangguan tissue luwih cepet saka tingkat ing RNase intraselular degrades RN.

Efek homogenizer listrik luwih apik,lan efek saka homogenizer kaca miskin, nanging ing umum, cara homogenizer ora bisa nyegah kedadean degradasi.Mulane, yen ekstraksi wis rusak, homogenizer listrik asli kudu digunakake kanggo nggiling karo nitrogen cair;homogenizer kaca asli kudu diganti dadi homogenizer listrik utawa langsung digiling karo nitrogen Cairan.Masalah kasebut meh 100% bisa ditindakake.njaluk mantun.

Masalah residu najis sing nyebabake eksperimen sakteruse nduweni panyebab sing luwih maneka warna tinimbang degradasi, lan solusi kasebut beda-beda.Kesimpulane,yen ana degradasi utawa sisa impurities ing jaringan, cara ekstraksi / reagen kanggo bahan eksperimen tartamtu kudu dioptimalake.Sampeyan ora kudu nggunakake conto larang regane kanggo Optimization: sampeyan bisa tuku sawetara kewan cilik kaya iwak / pitik saka pasar, njupuk bagean cocog saka materi kanggo extraction RNA, lan bagean liyane kanggo extraction protein – grind karo tutuk, weteng lan usus Extract.

Target RNA saka RNA sing diekstrak digunakake kanggo eksperimen tindak lanjut sing beda, lan syarat kualitase beda

Konstruksi perpustakaan cDNA mbutuhake integritas RNA tanpa residu inhibitor reaksi enzim;Lor mbutuhake integritas RNA sing luwih dhuwur lan syarat sing luwih murah kanggo residu inhibitor reaksi enzim;RT-PCR ora mbutuhake integritas RNA sing dhuwur banget,nanging nyegah reaksi enzim.Syarat residu ketat.Input nemtokake output;saben-saben tujuane kanggo entuk RNA kemurnian sing paling dhuwur, bakal biaya wong lan dhuwit.

Koleksi / Panyimpenan Sampel

Faktor sing Ngaruhi Degradasi Sawise sampel ninggalake awak urip / utawa lingkungan wutah asli, enzim endogen ing sampel bakal mulai ngrusak RNA,lan tingkat degradasi ana hubungane karo isi enzim endogen lan suhu.Cara tradisional, mung ana rong cara kanggo nyandhet aktivitas enzim endogen kanthi lengkap: nambah lysate kanthi cepet lan homogenisasi kanthi cepet lan cepet;Cut menyang bêsik cilik lan langsung beku ing nitrogen Cairan.Loro-lorone pendekatan mbutuhake operasi cepet.Sing terakhir cocok kanggo kabeh conto, dene sing pertama mung cocok kanggo jaringan kanthi isi sel sing kurang lan enzim endogen lan luwih gampang dihomogenake.Secara khusus, jaringan tanduran, ati, timus, pankreas, limpa, otak, lemak, jaringan otot, lan liya-liyane, paling apik dibeku karo nitrogen cair sadurunge nerusake.

Fragmentasi lan homogenisasi sampel

Faktor sing Ngaruhi Degradasi lan Ngasilake Fragmentasi Sampel yaikukanggo homogenisasi pepek, kang kanggo release lengkap lan lengkap RNA.Sèl bisa langsung homogenisasi tanpa rusak.Tisu bisa homogenisasi mung sawise rusak.Ragi lan bakteri kudu dipecah karo enzim sing cocog sadurunge bisa homogenisasi.Jaringan kanthi isi enzim endogen sing luwih murah lan homogenisasi sing luwih gampang bisa diremuk lan homogenisasi ing siji wektu ing lysate dening homogenizer;jaringan tanduran, ati, timus, pankreas, limpa, otak, lemak, jaringan otot lan conto liyane, Padha dhuwur ing enzim endogen utawa ora gampang homogenized,dadi gangguan jaringan lan homogenisasi kudu ditindakake kanthi kapisah.Cara fragmentasi sing paling dipercaya lan paling produktif yaiku penggilingan karo nitrogen cair, lan cara homogenisasi sing paling dipercaya yaiku nggunakake homogenizer listrik.Cathetan khusus babagan panggilingan kanthi nitrogen cair: sampel ora kudu dicairake sajrone proses panggilingan kabeh, amarga enzim endogen luwih bisa digunakake nalika beku.

Pilihan saka lysate

Ngaruhi penak operasi lan faktor residual impurities endogen Solusi lisis sing umum digunakake meh bisa nyandhet kegiatan RNase.Mulane, titik kunci milih solusi lisis yaiku nimbang kombinasi karo metode pemurnian.Ana siji pangecualian:conto karo isi enzim endogen dhuwur dianjurake kanggo nggunakake lysate ngemot fenol kanggo nambah kemampuan kanggo mateni enzim endogen.

Pilihan saka cara purifikasi

Faktor sing mengaruhi rereged endogen residual, kacepetan extraction Kanggo conto resik kayata sel, asil marem bisa dipikolehi karo meh kabeh cara pemurnian ing tangan.Nanging kanggo akeh conto liyane, utamane sing duwe tingkat impurities sing dhuwur kayata tanduran, ati, bakteri, lan sapiturute, milih cara pemurnian sing cocog penting banget.Cara pemurnian centrifugal kolom nduweni kecepatan ekstraksi sing cepet lan bisa ngilangi impurities sing bisa nyebabake reaksi enzimatik RNA sabanjure, nanging larang (Foregene bisa menehi kit sing larang regane, luwih rinci klikkene);nggunakake cara pemurnian ekonomi lan klasik, kayata udan LiCl, uga bisa entuk asil marem, nanging wektu operasi dawa..

"Telung Disiplin lan Wolung Perhatian" kanggo Ekstraksi RNA

Disiplin 1:Mungkasi kontaminasi enzim eksogen.

Cathetan 1:Nganggo masker lan sarung tangan kanthi ketat.

Cathetan 2:Tabung centrifuge, kepala tip, batang pipet, tangki elektroforesis, lan bangku eksperimen sing melu eksperimen kudu dibuwang kanthi lengkap.

Cathetan 3:Reagen/solusi sing ana ing eksperimen, utamane banyu, kudu bebas RNase.

Disiplin 2:Blok kegiatan enzim endogen

Cathetan 4:Pilih cara homogenisasi sing cocog.

Cathetan 5:Pilih lysate sing cocog.

Cathetan 6:Ngontrol jumlah wiwitan sampel.

Disiplin 3:Njlentrehake tujuan ekstraksi sampeyan

Cathetan 7:Kanthi sembarang sistem lysate nyedhak jumlah wiwitan maksimum sampel, tingkat sukses extraction mudhun banget.

Cathetan 8:Kriteria ekonomi mung kanggo ekstraksi RNA sing sukses yaiku sukses ing eksperimen sakteruse, ora ngasilake.

Top 10 Sumber Kontaminasi RNase

1. Driji minangka sumber pertama enzim eksogen, mula sarung tangan kudu dianggo lan asring diganti.Kajaba iku, topeng uga kudu dianggo, amarga napas uga minangka sumber enzim sing penting.Keuntungan tambahan nganggo topeng sarung tangan yaiku kanggo nglindhungi eksperimen.

2. Tip pipette, tabung centrifuge, pipettes - RNase ora bisa diaktifake dening sterilization piyambak, supaya tips pipette lan tabung centrifuge kudu dianggep karo DEPC, malah yen lagi ditandhani minangka DEPC dianggep.Paling apik nggunakake pipette khusus, ngilangke nganggo bal katun alkohol 75% sadurunge digunakake, utamane rod;Kajaba iku, dadi manawa ora nggunakake remover sirah.

3. Banyu/buffer kudu bebas saka kontaminasi RNase.

4. Paling ora meja test kudu dibusak resik karo 75% bal katun alkohol.

5.Endogen RNase Kabeh jaringan ngemot enzim endogen, supaya pembekuan cepet jaringan karo nitrogen Cairan cara paling apik kanggo ngurangi degradasi.Cara panyimpenan / penggilingan nitrogen cair pancen ora trep, nanging mung minangka cara kanggo jaringan kanthi tingkat enzim endogen sing dhuwur.

6. Sampel RNA Produk ekstraksi RNA bisa uga ngemot jejak kontaminasi RNase.

7. Ekstraksi plasmid Ekstraksi plasmid kerep nggunakake Rnase kanggo ngrusak RNA, lan Rnase sisa kudu dicerna karo Proteinase K lan diekstrak dening PCI.

8. Panyimpenan RNA Malah yen disimpen ing suhu kurang, jumlah tilak saka RNase bakal nimbulaké degradasi RNA.Solusi paling apik kanggo pengawetan RNA jangka panjang yaiku suspensi uyah / alkohol, amarga alkohol nyegah kabeh aktivitas enzimatik ing suhu sing kurang.

9. Nalika kation (Ca, Mg) ngemot ion-ion kasebut, pemanasan ing suhu 80C sajrone 5 menit bakal nyebabake RNA dipecah, mula yen RNA kudu dipanasake, solusi pengawetan kudu ngemot agen chelating (1mM Sodium Citrate, pH 6,4).

10. Enzim sing digunakake ing eksperimen sabanjure bisa kena kontaminasi dening RNase.

10 Tips kanggo RNA Extraction

1: Cepet nyegah kegiatan RNase.Sampel cepet beku sawise koleksi, lan RNase ora aktif kanthi operasi kanthi cepet sajrone lisis.

2: Pilih cara ekstraksi sing cocog kanggo jaringan kanthi kandungan ribozim sing dhuwur, lan jaringan adipose paling apik nggunakake metode sing ngemot fenol.

3: Kualitas prediksi mbutuhake Northern, construction perpustakaan cDNA mbutuhake integritas dhuwur, lan RT-PCR lan RPA (Ribonuclease pangayoman assay) ora mbutuhake integritas dhuwur.RT-PCR mbutuhake kemurnian dhuwur (residu inhibitor enzim).

4: homogenisasi pepek minangka kunci kanggo ningkatake asil lan nyuda degradasi.

5: Priksa integritas deteksi elektroforesis RNA, 28S: 18S = 2: 1 minangka tandha lengkap, 1: 1 uga bisa ditampa kanggo paling eksperimen.

6: Ngilangi DNA kanggo RT-PCR, analisis array Paling apik nggunakake Dnase I kanggo mbusak DNA.

7: Ngurangi kontaminasi enzim eksogen - enzim ora bisa diimpor saka njaba.

8: Nalika konsentrasi asam nukleat konsentrasi rendah, reagen co-precipitation kudu ditambahake.Nanging kanggo nyegah co-precipitant ngemot enzim lan kontaminasi DNA.

9: Sak tenane dissolve RNA, yen perlu, panas ing 65C kanggo 5 menit.

cara panyimpenan cocok

Bisa disimpen ing -20C kanggo wektu cendhak, lan ing -80C kanggo dangu.Langkah pisanan kanggo ningkatake asil RNA yaiku ngerteni manawa isi RNA saka macem-macem conto beda-beda.Kelimpahan dhuwur (2-4ug/mg) kayata ati, pankreas, jantung, kelimpahan medium (0,05-2ug/mg) kayata otak, embrio, ginjal, paru-paru, timus, ovarium, kurang kelimpahan (<0,05ug/mg) mg) kayata kandung kemih, balung, lemak.

1: Lyse sel kanggo ngeculake RN - yen RNA ora dirilis, asil bakal suda.Homogenisasi listrik luwih apik tinimbang metode homogenisasi liyane, nanging uga kudu digabungake karo metode liyane, kayata mashing nitrogen cair, pencernaan enzimatik (Lysozyme / Lyticase)

2: Optimization saka cara extraction.Masalah paling gedhe babagan metode adhedhasar fenol yaiku stratifikasi sing ora lengkap lan mundhut RNA parsial (supernatan ora bisa dicopot kabeh).Stratifikasi sing ora lengkap amarga kandungan asam nukleat lan protein sing dhuwur, sing bisa ditanggulangi kanthi nambah jumlah lysate sing digunakake utawa nyuda jumlah sampel.Langkah ekstraksi kloroform ditambahake ing jaringan adipose.Mundhut RNA bisa dikurangi kanthi back-pumping utawa mbusak lapisan organik sing diterusake kanthi sentrifugasi.Masalah paling gedhe karo metode basis centrifugation kolom yaiku keluwihan sampel.

Tip Ekstraksi Klasik

1. Pemurnian phenol: Tambah volume witjaksono 1: 1 Phenol / Chloroform lan nyampur vigorously kanggo 1-2 menit.Centrifuge ing kacepetan dhuwur kanggo 2 menit.Kasebut kanthi teliti, mbusak supernatant (80-90%).Aja nganti lapisan tengah.Volume sing padha saka solusi reaksi bisa ditambahake menyang Phenol / Chloroform lan supernatant dibusak.Loro supernatan kasebut bisa dicampur bebarengan kanggo presipitasi asam nukleat kanggo nambah asil.Aja banget lembut nalika nyampur, lan aja nyoba mbusak kabeh supernatant.

2. Ngumbah nganggo etanol 70-80%: Sajrone ngumbah, asam nukleat kudu dilereni soko tugas kanggo mesthekake yen uyah ampas wis sakabeheng adoh.Ing wektu sing padha, sanalika sawise pour etanol, centrifuge ing kacepetan dhuwur kanggo sawetara detik, banjur copot etanol ampas karo pipette.Dissolve sawise ngadeg ing suhu kamar kanggo 5-10 menit.

11. Ekstraksi organisasi khusus

1. Jaringan fibrosa: Kunci kanggo ekstraksi RNA saka jaringan fibrosa kayata otot jantung / balung yaiku ngganggu jaringan kasebut.Jaringan kasebut nduweni kapadhetan sel sing kurang, saengga jumlah RNA saben unit bobot jaringan kurang, lan luwih becik nggunakake jumlah wiwitan sing paling akeh.Dadi manawa kanggo tlatah tissue sak tenane ing kahanan beku.

2. Tisu kanthi kandungan protein/lemak dhuwur: isi lemak otak/sayur dhuwur.Sawise extraction PCI, supernatant ngandhut floccules putih.Supernatant kudu diekstraksi maneh nganggo kloroform.

3. Jaringan kanthi kandungan asam nukleat / ribozim sing dhuwur: limpa / timus nduweni kandungan asam nukleat lan ribozim sing dhuwur.Grinding jaringan ing kahanan beku sing diiringi homogenisasi kanthi cepet bisa kanthi efektif mateni ribozim.Nanging, yen lysate banget kenthel (amarga isi asam nukleat dhuwur), extraction PCI ora bisa stratify efektif;nambah lysate liyane bisa ngatasi masalah iki.Multiple extraction PCI bisa mbusak DNA ampas liyane.Yen endapan putih dibentuk langsung sawise nambahake alkohol, iki nuduhake kontaminasi DNA.Ekstraksi ulang karo PCI asam sawise pembubaran bisa mbusak kontaminasi DNA.

4. Jaringan tanduran: Jaringan tanduran luwih kompleks tinimbang jaringan kewan.Umume, tanduran dilebur ing kahanan nitrogen cair, mula degradasi RNA dening enzim endogen ora umum.Yen masalah degradasi ora ditanggulangi, meh mesthi disebabake impurities sing ana ing sampel.Impurities sing ana ing akeh tetanduran bakal mimpin kanggo residues, lan alesan kanggo residu asring amarga impurities iki duwe sawetara podho karo RNA: sampeyan precipitate lan aku precipitate, lan sampeyan adsorb lan aku adsorb.Karakteristik kasebut nemtokake manawa inhibitor enzim sing kuwat banget.

Saiki, reagen ekstraksi RNA komersial bisa diadaptasi kanggo meh kabeh jaringan kewan kanthi pangaturan cilik, nanging ana sawetara reagen ekstraksi RNA komersial sing bisa cocog kanggo umume jaringan tanduran.Begjanipun, Foregene bisa nyedhiyani khususkit ekstraksi RNA tanduran, kita duweKit Isolasi RNA Total Tanaman, Kit Isolasi RNA Total Tanaman Plus.Sing terakhir dirancang khusus kanggo tetanduran kanthi kandungan polisakarida lan polifenol sing dhuwur.Kanggo ekstraksi RNA, umpan balik saka pangguna lab utamane apik.

12. Efek pembekuan lan thawing sampel Sampel beku bisa uga luwih gedhe, lan kudu dipotong sadurunge digunakake kanggo ekstraksi RNA.Sampel cenderung leleh (bisa uga sebagian) nalika dipotong.Sampel beku bisa uga kudu ditimbang sadurunge ekstraksi RNA, lan thawing mesthi bakal kedadeyan sajrone proses iki.Kadhangkala, thawing saka sampel uga dumadi nalika proses panggilingan nitrogen Cairan;utawa sampel beku langsung ditambahake menyang lysate tanpa panggilingan nitrogen Cairan, lan thawing mesthi bakal kelakon sadurunge homogenization lengkap.Eksperimen wis nuduhake yen jaringan beku luwih rentan kanggo degradasi RNA sajrone thawing tinimbang jaringan seger.Kemungkinan alesan: Proses beku-thaw ngganggu struktur ing sel, dadi luwih gampang kanggo enzim endogen kanggo kontak langsung karo RNA.

13. Pengadilan kualitas RNA Biasane, elektroforesis digunakake kanggo ngadili integritas RNA, lan A260 / A280 digunakake kanggo ngadili kemurnian RNA.Ing teori, RNA utuh nduweni rasio 28S:18S = 2.7:1, lan umume data nandheske rasio 28S:18S = 2:1.Kasunyatane meh ora ana RNA sing diekstrak saka conto kajaba sel ing rasio 2: 1 (iki dijupuk nggunakake Agilent Bioanalyzer).

Asil elektroforesis RNA dipengaruhi dening akeh faktor, kalebu struktur sekunder, kondisi elektroforesis, beban sampel, tingkat kejenuhan dening EB, lsp. Gunakake elektroforesis asli kanggo ndeteksi RNA lan nggunakake Marker DNA minangka kontrol.Yen 28S ing 2kb lan 18S ing 0.9kb cetha, lan 28S: 18S > 1, integritas bisa nyukupi syarat paling eksperimen sakteruse.

A260 / A280 minangka indikator sing nyebabake akeh kebingungan.Kaping pisanan, perlu kanggo njlentrehake makna asli indikator iki kanggo asam nukleat: RNA murni, A260/280 = kira-kira 2.0.RNA murni minangka 'sabab' lan A260/A280 = 2 minangka 'efek'.Saiki kabeh wong nggunakake A260 / A280 minangka 'sabab', mikir yen "yen A260 / A280 = 2, mula RNA murni", sing bisa nyebabake kebingungan.

Yen sampeyan kasengsem, sampeyan bisa nambah reagen cilik sing asring digunakake ing ekstraksi, kayata fenol, guanidine isothiocyanate, PEG, lan liya-liyane, menyang sampel RNA, banjur ngukur rasio A260/A280.Kasunyatane yaiku akeh reagen sing digunakake kanggo ekstraksi RNA, uga akeh impurities ing sampel, nyerep sekitar A260 lan A280, sing mengaruhi A260/A280.

Pendekatan paling instruktif saiki yaiku mindai conto RNA ing kisaran 200-300 nm.Kurva RNA murni nduweni ciri ing ngisor iki: kurva alus, A230 lan A260 minangka rong titik infleksi, A300 cedhak 0, A260/A280 = watara 2,0, lan A260/A230 = watara 2,0.Yen data pindai ora kasedhiya, rasio A260/A230 uga kudu ditemtokake, amarga rasio iki luwih sensitif marang kabeh impurities sing mengaruhi reaksi enzimatik.Coba sawetara linear piranti (0.1–0.5 kanggo A260).

Ana rong fénoména migunani liyane: rasio bakal kurang saka 0,3 nalika A260 / A280 diukur ing banyu;nalika rasio sing diukur ing 10 mM EDTA kira-kira 0,2 luwih dhuwur tinimbang sing diukur ing 1 mM EDTA.

produk sing gegandhengan:

China Plant Total RNA Isolasi Kit Produsen lan Supplier |Foregene (foreivd.com)

RNA isolasi seri Suppliers lan Pabrik |Produsen seri isolasi RNA China (foreivd.com)

Seri isolasi RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)