1. Pangerten wiwitan

Ing tataran iki, kita kudu ngerti sawetara konsep lan terminologi, supaya ora nggawe kesalahan ing ngarepe senior kita, kayata:

P: Apa bedane antarane RT-PCR, qPCR, Real-time PCR, lan real-time RT-PCR?

Wangsulan: RT-PCR yaiku PCR transkripsi terbalik(reverse transcription PCR, RT-PCR), yaiku varian reaksi rantai polimerase (PCR) sing akeh digunakake.Ing RT-PCR, untaian RNA ditranskripsi mbalik dadi DNA komplementer, sing banjur digunakake minangka cithakan kanggo amplifikasi DNA dening PCR.
Real-time-PCR lan qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) iku padha, loro-lorone PCR kuantitatif nyata-wektu, kang tegese saben siklus PCR wis cathetan data nyata-wektu, supaya nomer Cithakan wiwitan bisa diatur analisis pas.

Senajan PCR Real-time (PCR kuantitatif fluoresensi wektu nyata) lan PCR transkripsi Reverse (PCR transkripsi terbalik) katon disingkat RT-PCR, konvensi internasional yaiku: RT-PCR khusus nuduhake transkripsi terbalik.PCR , Real-time PCR umume disingkat qPCR (quantitative real-time PCR).

Lan nyata-wektu RT-PCR (RT-qPCR), Iku PCR transkripsi mbalikke digabungake karo teknologi kuantitatif fluoresensi: pisanan entuk cDNA (RT) saka transkripsi mbalikke RNA, lan banjur nggunakake Real-time PCR kanggo analisis kuantitatif (qPCR).Umume laboratorium nindakake RT-qPCR, yaiku riset babagan ekspresi RNA mudhun-regulasi, saengga qPCR sing diomongake saben wong ing laboratorium bener-bener nuduhake RT-qPCR, nanging aja lali yen isih akeh tes DNA ing aplikasi klinis.Analisis kuantitatif, kayata deteksi virus hepatitis B HBV.

Pitakonan: Sawise maca akeh PCR kuantitatif neon, kenapa pecahan sing digedhekake kudu dikontrol ing kisaran 80-300bp?

Wangsulan: Dawane saben urutan gen beda-beda, sawetara sawetara kb, sawetara atusan bp, nanging kita mung kudu mbutuhake dawa produk dadi 80-300bp nalika ngrancang primer, cendhak banget utawa dawa banget ora cocok kanggo deteksi PCR kuantitatif fluoresensi .Fragmen produk cendhak banget kanggo dibedakake saka primer-dimer.Dawane primer-dimer kira-kira 30-40bp, lan angel kanggo mbedakake apa iku primer-dimer utawa produk yen kurang saka 80bp.Yen fragmen produk dawa banget, ngluwihi 300bp, bakal gampang nyebabake efisiensi amplifikasi sing kurang lan ora bisa ndeteksi jumlah gene kanthi efektif.

Contone, yen sampeyan ngitung jumlah wong ing kelas, sampeyan mung kudu ngetung jumlah cangkeme.Padha bener nalika ndeteksi gen, sampeyan mung kudu ndeteksi urutan tartamtu saka gen kanggo makili Kabeh urutan bakal nindakake.Yen sampeyan pengin ngetung wong, sampeyan kudu ngetung cangkeme lan irung, kuping, lan kaca tingal, lan gampang nggawe kesalahan.

Kanggo nggedhekake, ing riset biologi, ana akeh kasus riset saka titik menyang wilayah, amarga urutan gen saka sembarang spesies dawa banget, iku ora perlu lan mokal kanggo ngukur kabeh fragmen, kayata bakteri urutan 16S, kang kanggo nindakake urutan konservatif bakteri Assays kanggo infer nomer populasi tartamtu saka bakteri.

P: Apa dawa optimal kanggo desain primer qPCR?

Wangsulan: Umumé, dawa primer kira-kira 20-24bp, sing luwih apik.Mesthi, kita kudu menehi perhatian marang nilai TM saka primer nalika ngrancang primer, amarga iki ana hubungane karo suhu annealing sing optimal.Sawise akeh eksperimen, wis kabukten yen 60 ° C minangka nilai TM sing luwih apik.Yen suhu anil banget kurang, bakal gampang mimpin kanggo amplifikasi non-spesifik.Yen suhu annealing dhuwur banget, efisiensi amplifikasi bakal relatif kurang, puncak kurva amplifikasi bakal diwiwiti mengko, lan nilai CT bakal ditundha.

P: Kepiye cara pewarna beda karo metode probe?

Wangsulan: Metode pewarnaanSawetara pewarna neon, kayata SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, lan liya-liyane, ora ngetokake cahya dhewe, nanging bakal ngetokake fluoresensi sawise ngiket menyang alur cilik DNA untai ganda.Mulane, ing wiwitan reaksi PCR, mesin ora bisa ndeteksi sinyal neon.Nalika reaksi tekan tahap annealing-extension, untaian ganda dibukak, lan untaian anyar disintesis miturut aksi DNA polimerase, lan molekul fluoresensi ngiket menyang alur cilik dsDNA.Nalika jumlah siklus PCR mundhak, luwih akeh pewarna digabungake karo DNA untai ganda, lan sinyal fluoresensi uga terus ditingkatake.Cara pewarna utamane digunakake ing riset ilmiah.
PS: Ati-ati nalika nindakake eksperimen, pewarna kasebut kudu digabung karo DNA manungsa, ati-ati dadi wong sing neon.

Metode pewarnaan (kiri) Metode probe (kanan)
PS: Ati-ati nalika nindakake eksperimen, pewarna kasebut kudu digabung karo DNA manungsa, ati-ati dadi wong sing neon.

SYBR Green Ⅰ ngiket menyang alur cilik DNA

Metode probeProbe Taqman minangka probe hidrolisis sing paling umum digunakake.Ana klompok neon ing mburi 5′ probe, biasane FAM, lan probe dhewe minangka urutan pelengkap kanggo gen target.Ana klompok quenching fluoresensi ing mburi 3 '.Miturut prinsip transfer energi rampasan fluorescence (transfer energi rampasan förster, nalika molekul fluorescent sing apik banget (7-10nm), molekul fluorescent sing apik Lecule, dene autofluorescence saya ringkih.Mulane, ing wiwitan reaksi PCR, nalika probe gratis lan utuh ing sistem, klompok neon reporter ora bakal ngetokake fluoresensi.Nalika annealing, primer lan probe ikatan karo cithakan.Sajrone tahap extension, polimerase terus-terusan nyintesis rantai anyar.DNA polimerase nduweni aktivitas exonuclease 5′-3′.Nalika tekan probe, polimerase DNA bakal nghidrolisis probe saka cithakan, misahake klompok neon reporter saka klompok neon quencher, lan ngeculake sinyal neon.Amarga ana hubungan siji-kanggo-siji antarane probe lan cithakan, metode probe luwih unggul tinimbang metode pewarna ing babagan akurasi lan sensitivitas tes.Metode probe utamane digunakake ing diagnosis.

P: Apa kuantifikasi absolut?Apa Kuantasi Relatif?

Wangsulan: Kuantifikasi absolut nuduhake pitungan nomer salinan awal saka sampel sing bakal dites dening qPCR, kayata jumlah virus HBV ing 1ml getih.Asil sing dipikolehi kanthi kuantifikasi relatif yaiku owah-owahan jumlah gen target ing sampel tartamtu relatif marang sampel referensi liyane, lan ekspresi gen diatur munggah utawa diatur mudhun.

P: Apa jumlah ekstraksi RNA, efisiensi transkripsi terbalik, lan efisiensi amplifikasi bakal mengaruhi asil eksperimen?
P: Apa panyimpenan sampel, reagen ekstraksi, reagen transkripsi terbalik, lan bahan bakar sing ngirim cahya bakal mengaruhi asil eksperimen?
P: Cara apa sing bisa mbenerake data eksperimen?

Babagan masalah kasebut, kita bakal njlèntrèhaké kanthi rinci ing bagean lanjutan lan lanjutan ing ngisor iki.
2. Kawruh majeng

Babagan PCR kuantitatif neon nyata-nyata, kita kudu ngerteni kasunyatan manawa ewonan makalah riset ilmiah diterbitake saben taun, ing antarane teknologi PCR kuantitatif neon ora sithik.

Yen ora ana standar umum kanggo ngukur eksperimen PCR kuantitatif fluoresensi, asil bisa beda-beda.Kanggo gen sing padha saka spesies sing padha, kanthi cara pangolahan sing padha, asil deteksi uga bakal beda-beda, lan bakal angel kanggo wong sing telat mbaleni asil sing padha.Sampeyan Ora ana sing ngerti endi sing bener lan sing salah.

Apa tegese PCR kuantitatif fluoresensi minangka teknologi ngapusi utawa teknologi sing ora bisa dipercaya?Ora, amarga PCR kuantitatif neon luwih sensitif lan luwih akurat, lan operasi sing salah sithik bakal ngasilake asil sing ngelawan.A mundhut cilik iku ewu mil adoh.Penulis artikel bisa bola-bali disiksa dening para panyemak.Ing wektu sing padha, para panaliti jurnal uga angel milih saka asil eksperimen sing beda.

Kabeh, nuduhake kekurangan konsensus ing eksperimen PCR wektu nyata.Kanggo tujuan iki, ilmuwan senior ing industri wiwit ngramu standar,mbutuhake kontributor kanggo nyedhiyakake sawetara rincian eksperimen lan pangolahan data sing dibutuhake (kalebu data sing dibutuhake) ing artikel kasebut kanggo nyukupi standar kasebut.

Peninjau bisa ngadili kualitas eksperimen kanthi maca rincian kasebut;nonton mangsa uga bisa nggunakake iki kanggo mbaleni eksprimen utawa nambah eksprimen.Banjur asil eksperimen sing dipikolehi kanthi cara iki kebak informasi, kualitas dhuwur, lan bisa digunakake.

MIBBI (Informasi Minimum kanggo Penyelidikan Biologi lan Biomedis -http://www.mibbi.org) dumadi.MIBBI minangka proyek sing nyedhiyakake standar kanggo eksperimen.Iki diterbitake ing alam.Proyèk iki dituju ing macem-macem eksperimen biologi, kalebu biologi sel, Microarray, qPCR sing bakal kita bahas saiki, lan liya-liyane, lan nyedhiyakake saben jinis eksperimen nalika ngirim naskah.Informasi kasebut kudu diwenehake saben wektu.

Ing proyek MIBBI, ana rong artikel sing gegayutan karo PCR kuantitatif fluoresensi, yaiku:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – basa terstruktur lan panuntun pelaporan kanggo data PCR kuantitatif wektu nyata;
·MIQE (Informasi Minimum kanggo Publikasi Eksperimen PCR Wektu Nyata Kuantitatif) - informasi minimal kanggo nerbitake artikel babagan eksperimen PCR kuantitatif wektu nyata.
Pisanan, ayo ngomong babagan RDML, spesifikasi terminologi.

Yen ora ana definisi standar kanggo kabeh, ora bisa nerusake diskusi, mula penjelasan istilah kasebut penting banget ing ujian.
Terminologi sing digunakake ing eksperimen PCR kuantitatif fluoresensi kalebu konten ing ngisor iki.QIAGEN wis nggawe ringkesan paling apik kanggo kita.Ing ngisor iki kabeh garingbarang .

Kurva amplifikasi
Kurva amplifikasi nuduhake kurva sing digawe sajrone proses PCR, kanthi nomer siklus minangka absis lan intensitas fluoresensi wektu nyata sajrone reaksi minangka ordinat.

Kurva amplifikasi sing apik kudu nduweni karakteristik ing ngisor iki: garis dasar warata utawa rada suda, lan ora ana tren munggah sing jelas;titik inflection saka kurva cetha, lan slope saka phase eksponensial sebanding karo efficiency amplifikasi.Sing luwih gedhe slope, sing luwih dhuwur efisiensi amplifikasi;kurva amplifikasi sakabèhé Paralelisme apik, nuduhake yen efisiensi amplifikasi saben tabung padha;fase eksponensial kurva amplifikasi sampel konsentrasi rendah katon jelas.

Baseline (Baseline)
Baseline yaiku tingkat gangguan saka siklus awal, biasane diukur ing antarane siklus 3 lan 15, amarga kenaikan nilai fluoresensi sing disebabake dening produk amplifikasi ora bisa dideteksi sajrone periode kasebut.Jumlah siklus sing digunakake kanggo ngetung garis dasar bisa mawarni-warni lan bisa uga kudu dikurangi yen jumlah cithakan dhuwur digunakake utawa yen tingkat ekspresi gen target dhuwur.

Nyetel garis dasar mbutuhake ndeleng data fluoresensi saka kurva amplifikasi linearitas.Baseline disetel supaya wutah kurva amplifikasi diwiwiti kanthi nomer siklus luwih gedhe tinimbang nomer ndhuwur siklus baseline.Garis dasar kudu disetel kanthi individu kanggo saben urutan target.Nilai fluoresensi rata-rata sing dideteksi ing siklus awal kudu dikurangi saka nilai fluoresensi sing dipikolehi ing produk sing digedhekake.Versi paling anyar saka macem-macem piranti lunak PCR Real-Time ngidini optimasi otomatis setelan baseline kanggo sampel individu.

Sajrone sawetara siklus pisanan reaksi amplifikasi PCR, sinyal fluoresensi ora owah akeh.Nyedhak garis lurus diarani garis dasar, nanging yen dideleng kanthi teliti ing sawetara siklus pisanan, kita bakal weruh yen ing garis dasar yaiku apa sing kedadeyan ing gambar ing ngisor iki.

Latar Latar nuduhake
nilai fluoresensi non-spesifik ing reaksi.Contone: quenching fluoresensi ora efisien;utawa nomer akeh cithakan DNA pindho untaian amarga nggunakake SYBR Green.Komponen latar mburi sinyal kasebut sacara matématis dibusak dening algoritma piranti lunak PCR Real-Time.

Sinyal wartawan
Sinyal Reporter nuduhake sinyal fluoresensi sing diasilake dening SYBR Green utawa probe khusus urutan kanthi label fluoresensi sajrone Real-Time PCR.

Sinyal Reporter Normal (RN)
RN nuduhake intensitas fluoresensi pewarna reporter dibagi karo intensitas fluoresensi pewarna referensi pasif sing diukur ing saben siklus.

Pewarna Referensi Pasif
Ing sawetara PCR Real-Time,pewarna neon ROX digunakake minangka referensi internal kanggo normalake sinyal neon.Iki mbenerake variasi amarga pipetting sing ora akurat, posisi sumur, lan fluktuasi fluoresensi kanthi basis sumur.

Ambang fluoresensi (threshold)
wis diatur ndhuwur Nilai latar mburi lan Ngartekno ngisor Nilai plateau saka kurva amplifikasi.Iku kudu dumunung ing wilayah linear saka kurva amplifikasi, makili sawetara log-linear deteksi PCR.Ambang kudu disetel ing tampilan kurva log-amplifikasi supaya fase log-linear PCR gampang dingerteni.Yen ana sawetara gen target ing Real-Time PCR, batesan kudu disetel kanggo saben target .Umumé, sinyal fluoresensi saka 15 siklus pisanan reaksi PCR digunakake minangka sinyal latar mburi fluoresensi, lan batesan fluoresensi 10 kaping panyimpangan standar saka sinyal fluoresensi saka 3 nganti 15 siklus PCR pisanan, lan ambang fluoresensi disetel ing fase eksponensial amplifikasi PCR.Umumé, saben instrumen duwe ambang fluoresensi sing disetel sadurunge digunakake.

Cycle Threshold (CT) utawa Crossing Point (CP)
Siklus nalika kurva amplifikasi ngliwati ambang (yaiku, titik nalika deteksi fluoresensi mundhak kanthi signifikan).CT bisa dadi bagian sekedhik lan jumlah cithakan wiwitan bisa diwilang.Nilai CT nggambarake jumlah siklus sing dialami nalika sinyal fluoresensi ing saben tabung reaksi PCR tekan ambang sing disetel.Ana hubungan linear antarane nilai CT saben cithakan lan logaritma nomer salinan awal cithakan,luwih dhuwur nomer salinan awal, luwih cilik nilai CT, lan kosok balene.Kurva standar bisa digawe kanthi nggunakake standar kanthi nomer salinan awal sing dikenal, ing ngendi abscissa nggambarake nilai CT, lan ordinat nuduhake logaritma nomer salinan awal.Mulane, anggere nilai CT saka sampel sing ora dingerteni dipikolehi, nomer salinan awal sampel bisa diitung saka kurva standar.

Nilai ΔCT
Nilai ΔCT nggambarakeprabédan antarane gen target lan nilai CT gen referensi endogen sing cocog, kayata gen housekeeping, lan digunakake kanggo normalake jumlah cithakan sing digunakake:
⇒ΔCT = CT (gen target) - CT (gen referensi endogen)

Nilai ΔΔCT
Nilai ΔΔCT nggambarake prabédan antarane nilai rata-rata ΔΔCT saka sampel kapentingan (contone, sel sing dirangsang) lan nilai rata-rata ΔΔCT saka sampel referensi (contone, sel sing ora dirangsang).Sampel referensi uga disebut sampel kalibrasi lan kabeh conto liyane dinormalisasi kanggo kuantifikasi relatif:
⇒ΔΔCT = rata-rata ΔCT (sampel kapentingan) - rata-rata ΔCT (sampel referensi)

Gen referensi endogen (gen referensi endogen)
Tingkat ekspresi gen referensi endogen, kayata gen housekeeping (gen housekeeping), ora beda antarane sampel.Mbandhingake nilai CT saka gen referensi karo gen target ngidini tingkat ekspresi gen target bisa dinormalisasi karo jumlah input RNA utawa cDNA (deleng bagean babagan nilai ΔCT ing ndhuwur).

Gen referensi internal sing bener kanggokemungkinan degradasi RNA utawa anané inhibitor enzim ing conto RNA, uga variasi isi RNA, efisiensi transkripsi terbalik, pemulihan asam nukleat, lan penanganan sampel.Kanggo milih gen referensi optimal (s), kita diowahi algoritma kanggo ngidini pilihan saka referensi optimal gumantung ing setelan eksperimen.

Kontrol internal
Urutan kontrol sing digedhekake ing reaksi sing padha karo urutan target lan diselidiki nganggo probe sing beda (yaiku, nindakake PCR duplex).Kontrol internal asring digunakake kanggo ngilangi amplifikasi sing gagal, kayata nalika urutan target ora dideteksi.
Sampel Kalibrasi
Sampel referensi (contone, RNA sing diresiki saka garis sel utawa jaringan) digunakake ing kuantifikasi relatif kanggo mbandhingake kabeh conto liyane kanggo nemtokake tingkat ekspresi relatif saka gen.Sampel kalibrasi bisa dadi sampel apa wae, nanging biasane kontrol (contone, sampel sing ora diobati utawa sampel saka wektu nol eksperimen).

Kontrol positif
nggunakake reaksi kontrol karodikenal jumlah Cithakan.Kontrol positif asring digunakake kanggo mriksa manawa set primer utawa set probe primer bisa digunakake kanthi bener lan yen reaksi wis disetel kanthi bener.

Ora ana Kontrol Cithakan (NTC)
Reaksi kontrol sing ngemot kabeh komponen reaksi amplifikasi sing dibutuhake kajaba cithakan, sing biasane diganti karo banyu.Panggunaan NTC bisa nemokake kontaminasi sing disebabake dening kontaminasi reagen utawa DNA asing, saéngga njamin keaslian lan linuwih data deteksi.Amplifikasi kontrol NTC nuduhake kontaminasi.

Ora ana kontrol RT (NRT)
Proses ekstraksi RNA bisa uga ngemot sisa DNA genomik, sing mbebayani banget lan nyebabake kualitas data lan musuh alami qPCR, mula nalika ngrancang eksperimen, kudu dirancang mung kanggo nggedhekake deteksi RNA.Ana rong cara, sing siji yaiku ngrancang primer ing intron, sing liyane yaiku mbusak DNA kanthi lengkap, sing luwih apik, sing bakal dibahas mengko.Kontrol NTR minangka pangilon ajaib kanggo ndeteksi polusi DNA.Yen ana amplifikasi, tegese ana polusi.

Standar
Standar minangka conto konsentrasi sing dikenal utawa nomer salinan sing digunakake kanggo mbangun kurva standar.Kanggo njamin stabilitas standar, fragmen gen biasane dikloning menyang plasmid lan digunakake minangka standar.

Kurva standar
biasane diencerke ing paling 5 gradien konsentrasi karo produk standar miturut rasio dobel, lan 5 TCTerms digambar ing koordinat Nilai CT lan nomer salinan, lan TCTerms disambungake kanggo mbentuk baris kanggo generate kurva standar.Kanggo saben kurva standar, validitase kudu dipriksa.Nilai slope tumiba ing antarane -3,3 lan -3,8, lan saben konsentrasi dileksanakake ing rangkap tiga.Titik sing beda banget karo poin liyane kudu dibuwang.Nilai CT saka sampel sing bakal diuji digawa menyang kurva standar, lan tingkat ekspresi sampel sing bakal diuji bisa diitung.

Nilai CT saka sampel sing bakal diuji digawa menyang kurva standar, lan nomer salinan awal saka sampel sing bakal diuji bisa diitung.

Efisiensi lan Slope
Kemiringan kurva standar nggambarake efisiensi PCR wektu nyata.
· Kemiringan -3,322 nuduhake yen efisiensi amplifikasi PCR yaiku 1, utawa 100% efisien, lan jumlah produk PCR tikel kaping pindho ing saben siklus.
· Kemiringan kurang saka -3,322 (contone, -3,8) nuduhake efisiensi PCR
· A slope luwih saka -3.322 (contone, -3.0) nuduhake yen efficiency PCR katon luwih saka 100%, kang penasaran, carane siji siklus PCR bisa ngasilake luwih saka pindho produk digedhèkaké?Kahanan iki dumadi ing fase non-linear reaksi PCR, yaiku, ana akeh amplifikasi non-spesifik.

kurva leleh
Sawise amplifikasi qPCR rampung, produk PCR digawe panas.Nalika suhu mundhak, produk amplifikasi untaian ganda alon-alon leleh, nyebabake nyuda intensitas fluoresensi.Nalika suhu tartamtu (Tm) tekan, akeh produk bakal leleh.Fluoresensi mudhun banget.Produk PCR sing beda-beda duweni nilai Tm sing beda lan suhu leleh sing beda, saengga kekhususan PCR bisa diidentifikasi.

Kurva lebur (kurva turunan)
Kurva leleh diturunake kanggo mbentuk peta puncak, sing bisa nampilake kahanan fragmen produk PCR kanthi luwih intuisi.Wiwit suhu leleh minangka nilai Tm saka fragmen DNA, sawetara paramèter sing mengaruhi nilai Tm saka fragmen DNA bisa diadili, kayata ukuran fragmen, isi GC, lan liya-liyane. Umumé, miturut prinsip desain sepisanan kita,dawa produk amplified ing sawetara 80-300bp, supaya suhu leleh kudu antarane 80 ° C lan 90 ° C.

Interpretasi kurva leleh: Yen siji-sijine puncak utama katon ing antarane 80 ° C-90 ° C, tegese PCR kuantitatif fluoresensi sampurna;yen puncak utama katon ing antarane 80 ° C-90 ° C lan macem-macem puncak katon ing ngisor 80 ° C, dimer primer dianggep dhasar.Sampeyan bisa nyoba kanggo nambah suhu annealing kanggo ngatasi;yen puncak utama katon antarane 80 ° C-90 ° C, lan puncak macem-macem katon maneh nalika suhu mundhak, Sejatine dianggep ana kontaminasi DNA, lan DNA kudu dibusak ing tataran awal saka eksperimen.

Mesthi, isih ana sawetara kahanan sing ora normal, sing bakal dipecah siji-siji ing ngisor iki.
3. Kawruh majeng

Kanggo nindakake qPCR, aku kudu ngomong MIQE,Informasi Minimalkanggo Publikasi sakaKuantitatifPCR Real-TimeEksperimen - informasi minimal kanggo nerbitake artikel babagan PCR kuantitatif wektu nyataeksperimen .Kanggo nyederhanakake pangerten saben wong, kita bakal nyederhanakake isi utama.

Sampeyan bisa nelusuri teks asli MIQE ing Internet, lan sing paling penting iku stipulates ingdaftar priksa data sing kudu disedhiyakake nalika nerbitake artikel .

Peninjau bisa ngadili kualitas eksperimen kanthi maca rincian kasebut;nonton mangsa uga bisa nggunakake iki kanggo mbaleni utawa nambah eksprimen.
Wigati dicathet yen ing dhaptar iki, pentinge saben dhaptar ditandhani kanthi E utawa D.Iki artine apa?E: informasi penting (kudu diajukake);D: informasi sing dikarepake (nyedhiyakake sabisa-bisa).

MIQE (1)—Desain Eksperimental
Akeh bajingan sing wis rampung pertahanan sawise rampung sinau lulusan ora bakal ngerti carane ngrancang eksperimen kanthi mandiri, mbukak notebook, lan nindakake apa sing didhawuhake guru.Akibaté, desain eksperimen ora kaku, lan departemen editor saka majalah ngandika sing padha arep nggawe gambar iki lan gambar sing, supaya padha nindakake ing daze.Iki carane scumbags digawe!

Nyedhaki omah, prinsip pertama eksperimen yaiku kanggo nemtokakekaku saka logika eksperimen.Sing paling dhasar yaiku desain eksperimen, lan sing paling penting babagan desain eksperimen yaiku carane nyetel sampel target, sampel referensi (kontrol), lan jumlah ulangan, supaya data eksperimen bisa referensi, bisa dibandhingake, lan yakin.

Sampel targetnuduhake sampel sing mbutuhake kita ndeteksi gen target sawise perawatan tartamtu.Sampel referensiminangka sampel tanpa perawatan, sing asring diarani minangka jinis liar ing biologi.

Replika eksperimentalpenting banget.Umume, jumlah replika persuasif kudu luwih saka telung.Perlu mbedakake apa replikasi biologis lan apa replikasi teknis.

Replika Biologis: Eksperimen verifikasi sing padha ditindakake kanthi bahan sing beda (wektu, tanduran, batch, piring reaksi).

Duplikasi biologis
Ayo dadi conto perawatan pestisida mrico.Kita pengin nyemprotake pestisida ing telung tanduran ABC, banjur telung tanduran ABC yaiku telung replika biologis, lan eksperimen verifikasi sing padha ditindakake kanthi bahan sing beda.Nanging minangka eksperimen, kontrol mesthi dibutuhake, supaya kita bisa nyemprotake salah sawijining cabang tanduran A kanggo mbentuk klompok eksperimen tanduran A, lan ora nyemprotake cabang liyane saka tanduran A kanggo mbentuk klompok kontrol.Tumindak sing padha kanggo B lan C.

Replika Teknis (Replika Teknis): Iki minangka eksperimen bola-bali sing dirancang kanggo nyegah kesalahan sing disebabake dening operasi, sing sejatine minangka bolongan duplikat sing kalebu ing materi sing padha.Loro-lorone perawatan lan kontrol kudu duwe setelan replikasi (minimal telung) saka gen target lan gen referensi internal.

Pengulangan teknis
Coba conto maneh mrico sing diolah nganggo pestisida.Kanggo klompok eksperimen tanduran A, kita nggawe telung bolongan PCR 1, 2, lan 3 kanggo gen target lan gen referensi internal, supaya bisa njupuk rata-rata sawise deteksi.Kanggo kontrol tanduran A Groups uga dianggep ing cara sing padha.Kajaba iku, tindakake perawatan sing padha kanggo tanduran B lan C.Iki minangka pengulangan teknis.

Iku worth kang lagi nyimak singapa sing dilebokake ing statistik yaiku pengulangan biologis, lan pengulangan teknis yaiku kanggo nguji manawa ana fenomena acak ing proses eksperimen, supaya asil eksperimen bisa dipercaya, yaiku, kanggo ngindhari kesalahan kanthi njupuk rata-rata kaya sing asring kita ucapake.

Kontrol Negatif-NTC lan NRT
NTC (No-Template Control), kontrol tanpa cithakan, digunakake kanggo verifikasi apa materi eksperimen wis ono racune.Umume, banyu digunakake minangka cithakan.Yen ana reaksi fluoresensi, iki nuduhake yen kontaminasi asam nukleat wis kedadeyan ing laboratorium.

Polusi kasebut asale saka: banyu sing ora resik, reagen tanpa syarat sing ngemot DNA endogen, polusi primer, polusi peralatan laboratorium, polusi aerosol, lan liya-liyane, kudu nggunakake pemulung RNase lan inhibitor RNase.Polusi aerosol paling angel ditemokake.Bayangake laboratorium sampeyan kaya smog, kanthi macem-macem asam nukleat sing digantung ing udara.

NRT (No-Reverse Transcriptase), kontrol tanpa transkripsi mbalikke, punika non-reverse transkripsi RNA minangka kontrol negatif, kang kontrol residu gDNA.

Nalika nindakake ekspresi gen, jumlah RNA dideteksi kanthi ndeteksi jumlah cDNA sawise transkripsi mbalikke.Yen ana residu gDNA nalika RNA diresiki, bakal nyebabake kesalahan ing asil eksperimen, amarga asil nyata sing dipikolehi yaiku gDNA lan cDNA.Ing tingkat agregat, ora mung cDNA, gDNA kudu dibusak kanthi lengkap sajrone ekstraksi RNA.

MIQE (2)—informasi sampel
Informasi sampel sing diarani tegese nalika nerbitake artikel babagan qPCR, kita kudu nerangake informasi sampel kanthi jelas, sing minangka bagean penting saka artikel kasebut.Kajaba iku, nalika kita ngolah conto, kita uga kudu ngatur operasi kita dhewe kanggo njamin kesahihan conto kasebut.

Katrangan saka sampel mung asil, lan kita kudu mbayar manungsa waé liyane kanggo bahan dijupuk sak kabèh eksperimen.

Pamilihan bahan eksperimen
Sampel getih - pilih getih seger, ora luwih saka 4 jam.Sampel sel - milih kanggo ngumpulake sel seger ing wektu wutah sing kuat.Tisu Kewan-Pilih jaringan sing seger lan sregep tuwuh.Tisu Tanduran - Pilih jaringan enom sing seger.

Sampeyan kudu ngelingi yen ana tembung kunci ing sawetara ukara iki: seger .
Kanggo conto ing ndhuwur, kit sing paling apik, larang regane, lan stabil ing pasar yaiku kit Foregene, sing bisa kanthi cepet lan gampang ngekstrak DNA lan RNA.

Kit Mini DNA getih

Kit Isolasi RNA Total Sel

Kit Isolasi RNA Total Kewan

Kit Isolasi RNA Total Tanduran

Tanduran Total RNA Isolasi Kit Plus

Kit Isolasi DNA Tumbuhan

Panyimpenan bahan eksperimen
Umumé, kita ora nyaranake nyimpen conto, yen kahanan ngidini.Nanging, ana akeh kanca sing ora bisa nindakake eksperimen langsung sawise sampling, lan sawetara malah kudu nggawa tank nitrogen Cairan menyang lapangan kanggo sampling.

Kanggo kanca sing kerja keras iki, aku mung bisa ngomong yen sampeyan ora ngerti bahan konsumsi reagen.Saiki akeh perusahaan consumable reagen ngasilake reagen sing bisa nyimpen conto RNA ing suhu kamar, lan sampeyan bisa milih nggunakake.Cara panyimpenan konvensional yaiku panyimpenan nitrogen cair, nggunakake tangki nitrogen cair cilik sing gampang digawa.Sawise nggawa sampel bali menyang laboratorium, simpen ing kulkas -80 ° C.

Kanggo eksperimen sing nglibatake RNA, prinsip enem tembung kudu ditindakake:suhu kurang, ora ana enzim,lancepet .

Konsep suhu kurang gampang dingerteni;tanpa enzim, RNase nang endi wae ing donya kita manggon ing (yen sampeyan wis matèni HIV), supaya carane supaya RNase nalika nindakake nyobi iku konsep penting banget;cepet,Ora ana Kung Fu ing jagad iki sing ora bisa rusak, mung kacepetan sing ora bisa rusak.

Mulane, ing pangertèn, luwih cendhek wektu ekstraksi, luwih apik kit kasebut.NgapaForegene'S kit nandheske kacepetan, amarga padha ngerti uga.

PS: Sawetara bocah wadon nindakake eksperimen kanthi ati-ati, nanging ora kaya slam dunk sawise sawetara taun kerja.Wong-wong kuwi ngrasa nèk Gusti Allah ora adil, ngeluh marang wong liya, lan nggolèki urip.Nyatane, dheweke ora ngerti.Dheweke ora nglindhungi RNA kanthi apik, lan pemain slam dunk lincah.Nalika nindakake eksperimen, dheweke mikir yen dheweke bakal ngrampungake slam dunk kanthi kaping telu, kaping lima lan rong divisi, nanging dheweke nindakake eksperimen kasebut kanthi apik.

Cathetan: Luwih alon, luwih akeh kemungkinan invasi RNase.Kepiye carane nglatih awak supaya cepet?Ora ana cara, mung latihan luwih akeh.

Kanggo eksperimen sing beda-beda lan conto sing beda-beda, isih perlu maca luwih akeh literatur lan milih cara sing cocog kanggo diproses.Kanggo koleksi sampel lan proses panyimpenan, MIQE mbutuhake kudu ditulis kanthi cetha ing kertas, supaya para panaliti bisa nyemak linuwih kertas kasebut, lan uga trep kanggo bocah-bocah sing kaget ngulang eksperimen sampeyan.

Senajan eksperimen biologi angel, nanging dhuwur-mburi.Yen ora ngati-ati, sampeyan bisa mbalikke jagad.Contone, nggawe SARS dadi krisis biokimia, utawa nggawe beras hibrida kanggo nylametake 1,3 milyar wong.Gambar ing ngisor iki minangka eksperimen kimia, sampeyan kudu ngerti carane bangga riset sampeyan mung kanthi ndeleng penampilan sing kaya kontol.Lali, aja ireng dheweke.

MIQE (3) - ekstraksi asam nukleat.
Ekstraksi asam nukleat minangka acara gedhe, lan kabeh eksperimen biologi molekuler diwiwiti kanthi ekstraksi asam nukleat.Kaping pisanan, ayo nyalin konten MIQE babagan ekstraksi asam nukleat.

Nggoleki formulir iki, sampeyan ora bisa tetep ing permukaan.Wangun kasebut minangka dogma.Kanggo dadi siswa sing paling dhuwur, sampeyan kudu takon kenapa.Isi penting saka tabel iki yaiku: Nguberkemurnian, integritas, konsistensi, lan jumlah ekstraksi RNA .

Bagian pisanan sakaproses utawa instrumen yaiku langkah ekstraksi asam nukleat.Yen sampeyan nggunakake extractor asam nukleat otomatis kanggo extract (maju, hubungi kula kanggo tuku), sampeyan kudu nunjukaké jeneng model instrument.

Jeneng kit lan

kit apa sing digunakake kanggo rincian pangowahan, reagen khusus apa sing ditambahake utawa operasi khusus sing ditindakake kudu diterangake kanthi jelas supaya wong liya bisa ngulang eksperimen sampeyan kanthi gampang.

Sawetara wong nambah sawetara reagen khusus nalika njupuk conto khusus, mikir yen iki senjata rahasia lan ora ngandhani wong liya.Nalika tetep rahasia, dheweke uga kelangan kesempatan kanggo nggawe artikel sampeyan sumunar.Aja pinter-pinter, kudu luwih jujur ​​tinimbang Zhang ing negarane ing riset ilmiah, yen sampeyan pengin pinter, artikel kasebut bakal nggawe sampeyan bodho.

kudu ngelingi nomer produk kitnalika sampeyan pesen kit lan nulis artikel.Umume ana rong nomer ing kit: Cat-nomer katalog (nomer produk, nomer artikel), Lot-nomer lot produk (Digunakake kanggo nunjukake saka batch produk kasebut).

Kajaba iku, nomer CAS asring digunakake nalika pesenan reagen biokimia, lan aku bakal popularize bebarengan.Nomer CAS minangka nomer sing diwenehake dening American Chemical Society kanggo saben obat kimia anyar.Umumé, telung nomer disambungake dening mlayu.Nomer CAS Rushui: 7732-18-5.Bahan kimia asring duwe sawetara alias, nanging nomer CAS unik.Nalika pesen obat, sampeyan bisa mriksa nomer CAS dhisik.

Luwih cedhak karo omah, kenapa kita kudu nggambarake perkara kasebut kanthi jelas?Nyatane, uga kanggo mriksa kualitas ekstraksi RNA.Panganggone instrumen lan kit bakal nggawe ekstraksi RNA luwih konsisten.Skala ekstraksi laboratorium biasa ora gedhe, lan bisa dipikolehi nganggo kit.

Rincian perawatan DNase utawa RNase
Masalah penting PCR kuantitatif fluoresensi yaiku nyegah kontaminasi DNA, lan aja nyoba yen ana kontaminasi.Mulane, penting kanggo nyatakake proses sing digunakake kanggo ngolah DNA, supaya bisa nduduhake yen DNA ing proses eksperimen wis dibusak kanthi lengkap.diwakili dening diagram skematis.

Diagram skematis RNA lan DNA
Umumé, cara kanggo ngilangi DNA yaiku ngobati RNA nganggo DNase sawise ekstraksi.Nanging, iki cara sing relatif lawas.Kit ekstraksi RNA komersial wis bisa mbusak DNA sajrone proses ekstraksi tanpa nambahake DNase.Contone, seri kit saka Foregene.

Cathetan: Ngilangi DNA sajrone ekstraksi RNA minangka pedhang kanthi ujung ganda sing mbebayani, sing bakal ndawakake wektu operasi ekstraksi RNA lan nambah risiko degradasi RNA.Sejatine, iki minangka trade-off antarane ngasilake RNA lan kemurnian.

Kajaba iku, jumlah DNase sing ditambahake ing kolom adsorpsi basis silika cilik banget, lan DNase sing berkualitas kudu digunakake kanggo entuk efek kasebut.DNase sing ora dioptimalake ora bisa dicerna kanthi cepet lan lengkap.Iki minangka tes tingkat teknis pedagang.Mesthine, ana pedagang sing luwih aneh sing gumunggung yen DNA bisa dicopot tanpa DNase.Bisa diarani sapa wae sing ngegung-egungake yen DNA bisa dicopot tanpa DNase iku hooligan.DNA minangka struktur untaian ganda sing relatif stabil, lan ora bisa dibusak mung kanthi ngomong lan ngguyu.

Assessment kontaminasi
metode penilaian: deteksi elektroforesis, 1% agarose, 6V/cm, 15 menit, loading 1-3 ul

Analisis kuantitatif asam nukleat
biasane diukur nggunakake spektrofotometer UV.Ayo kula pisanan popularize makna saka telung nilai OD260, OD280, lan OD230.
·OD260nm: Dawane gelombang panyerepan saka puncak panyerepan paling dhuwur saka asam nukleat, lan nilai diukur paling apik antara 0.1 nganti 1.0.Yen ora, dilute utawa konsentrasi sampel kanggo nggawa ing jangkoan.
·OD280nm: Iku dawa gelombang panyerepan saka puncak panyerepan paling saka protein lan bahan kimia phenolic.
·OD230nm: Iku dawa gelombang panyerepan saka puncak panyerepan paling dhuwur saka karbohidrat.

Sabanjure, ayo ngomong babagan peran saben indikator.Kanggo A260, bisa digunakake kanggo ngukur asil asam nukleat.Nalika OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Kanggo kemurnian, kita kudu ndeleng rasio sing umum kita deleng: OD260/280 lan OD260/230.
· DNA murni: OD260/280 kira-kira padha karo 1,8.Yen luwih saka 1,9, nuduhake yen ana polusi RNA, lan yen kurang saka 1,6, nuduhake yen ana polusi protein lan fenol.
RNA murni: 1.7
·OD260/230: Apa DNA utawa RNA, nilai referensi 2,5.Yen kurang saka 2.0, nuduhake yen ana polusi gula, uyah lan bahan organik.

integritas RNA

Penting banget kanggo ngukur integritas RNA.Umumé, perlu kanggo nindakake eksperimen gel denaturasi RNA kanggo mriksa apa padhange antarane 28S lan 18S RNA minangka hubungan loro.Nalika pita katelu 5S katon, tegese RNA wis mulai ngrusak, kajaba invertebrata.

Data kanggo penilaian kualitas RNA: Saliyane tes ing ndhuwur, ana uga sawetara tes instrumen sing luwih maju babagan integritas RNA, kayata tes integritas RQI saka sistem elektroforesis otomatis Experion, sing bisa ndeteksi manawa RNA rusak kanthi ora katon.

Ing riset ilmiah, PCR kuantitatif fluoresensi minangka perbandingan antara gen target lan gen referensi internal.Mulane, ing proses pengawetan sampel RNA, ekstraksi RNA, lan liya-liyane, tujuan utamane yaiku kanggo njamin integritas RNA.

Kepiye integritas RNA mengaruhi keseimbangan antarane gen target lan gen referensi internal bisa dimangerteni kanthi gampang saka gambar ing ngisor iki.Degradasi bakal mimpin kanggo incompleteness gen, apa iku incompleteness saka gen referensi internal utawa incompleteness saka gen target, iku bakal duwe impact gedhe ing data.

Diagram skematis gen target lan gen referensi, mesthine ora bener

Tes inhibisi (apa nilai CT ditindhes ing konsentrasi dhuwur utawa kurang utawa kahanan liyane)

Njupuk tokoh iki minangka conto, nilai Ct saka limang kurva kaya ing ngisor iki.Distribusi nilai CT ing antarane kurva ora rata, lan nilai Ct ditundha ing konsentrasi dhuwur lan kurang, yaiku kasus inhibisi PCR.

Titik utama: Ing proses ekstraksi RNA, kita kudu ninggalake misconceptions lan netepake sing bener.

Gagasan sing salah yaiku: Ekstraksi RNA mung ngupayakake asil, mikir yen luwih gedhe jumlah RNA sing dipikolehi, luwih apik.Nyatane, nalika kita nindakake kuantifikasi, yen jumlah gen ora akeh banget, kita ora butuh RNA akeh.Jumlah RNA sing dijupuk luwih saka cukup.

Konsep sing bener yaiku:Ekstraksi RNA kudu ngupayakake kemurnian, integritas lan konsistensi.Kemurnian bisa mesthekake yen transkripsi mbalikke sabanjure ora dicegah lan data ora bakal kena pengaruh DNA.Integritas njamin keseimbangan urutan target lan referensi internal.Konsistensi njamin loading sampel stabil.

MIQE (4) - transkripsi mbalikke
Salah sangka: nguber volume sampel sing luwih dhuwur.
Konsep sing bener: Ngupaya konsistensi (stabilitas), preduli saka jumlah RNA dimuat, efficiency transkripsi mbalikke tetep konsisten, mesthekake yen beda ing cDNA saestu bisa nggambarake beda ing mRNA.
Kita nerangake proses iki kanthi diagram skematik:

Diagram skematis efisiensi transkripsi terbalik, ora bener
Kaping pisanan, kita kudu ngerti bedane proses transkripsi terbalik lan proses PCR.PCR ngalami pirang-pirang proses pemanasan lan anil, lan fragmen target tuwuh kanthi eksponensial;nalika transkripsi mbalikke ora duwe proses iki, kita bisa mbayangno yen transkripsi mbalikke iku bener siji-kanggo-siji Sajrone proses replikasi, minangka akeh potongan RNA.

amarga ana sing bisa entuk akeh potongan Informasi cDNA, mula kudu dingerteni saiki, amarga pecahan gedhe lan cilik wis ditranskripsi mbalikke, lan ora bisa fokus ing siji fragmen.Lan amarga jumlah RNA relatif cilik, jumlah cDNA sing dipikolehi uga relatif cilik, ora kaya PCR, sing nduweni efek amplifikasi, mula ora bisa dideteksi.

Hasil elektroforesis cDNA
Sareh, saenipun, transkripsi mbalikke dileksanakake siji-kanggo-siji, nanging ora transcriptase mbalikke saka perusahaan sembarang bisa entuk efek iki.Sejatine, efisiensi transkripase paling mbalikke ngumbara antarane 30-50%.Yen ngono, kita luwih seneng duwe efisiensi transkripsi mbalikke sing relatif stabil, yaiku sing pengin dideleng ing gambar kasebut: 3 RNA entuk 2 cDNA, 6 RNA entuk 4 cDNA, dadi ora ketompo carane akeh sampel dimuat, efisiensi transkripsi mbalikke relatif stabil.Kita ora pengin ndeleng kahanan sing efisiensi transkripsi mbalikke ora stabil lan konsentrasi dhuwur dicegah.

Dadi, kepiye carane verifikasi manawa efisiensi transkripsi mbalikke stabil?Cara banget prasaja, sampeyan mung kudu nindakake test comparison: siji kanggo mbalikke transcribe menyang cDNA sawise dobel pengenceran saka RNA, lan liyane kanggo nggawe dobel ngencerake sawise mbalikke transcribe menyang cDNA, lan banjur nindakake qPCR kanggo ndeleng slope dijupuk Apa konsisten.Minangka siswa paling dhuwur, sampeyan kudu ngerti ing sawetara detik.Kaya sing kapacak ing ngisor iki:

Pengenceran RNA lan cDNA kanggo nguji apa efisiensi transkripsi mbalikke stabil
Reverse transcriptase lan kit
Kepiye PCR kuantitatif neon sing sampurna duwe transkripase lan kit terbalik sing apik.Reverse transcriptase kira-kira dipérang dadi rong jinis miturut sumber, AMV utawaM-MLV, lan kinerja padha karo sing ditampilake ing tabel.

Aktivitas RNase H
RNase H yaiku Ribonuclease H, jeneng Cina yaiku ribonuclease H, yaiku endoribonuklease sing bisa nghidrolisis RNA sacara khusus ing rantai hibrida DNA-RNA.RNase H ora bisa nghidrolisis ikatan fosfodiester ing DNA utawa RNA untai tunggal utawa untai ganda, yaiku, ora bisa nyerna DNA utawa RNA untai tunggal utawa ganda.Biasane digunakake ing sintesis untaian kapindho cDNA.

Iku aneh.Kita ngomong yen reverse transcriptase nduweni aktivitas RNase H, ora yen reverse transcriptase ngemot RNase H, lan bisa uga ora bisa misahake RNase H saka reverse transcriptase, mbok menawa amarga konformasi kelompok tartamtu ing reverse transcriptase Aktivitas iki disebabake dening reverse transcriptase.

Mulane, preduli saka efisiensi transkripsi terbalik sing luwih dhuwur saka AMV, aktivitas RNase H nyuda ngasilake cDNA.Mesthine, manufaktur reagen terus-terusan ngoptimalake produk kanggo ngilangi aktivitas RNase H ing transkripase terbalik sabisa-bisa kanggo nambah asil cDNA.
Suhu Annealing

Struktur sekunder RNA ing suhu sing beda
Deleng tokoh ing ndhuwur kanggo struktur sekunder RNA ing suhu sing beda-beda, lan gunakake alat online mFold kanggo nemtokake struktur sekunder saka pecahan target ing suhu tartamtu lan kondisi konsentrasi uyah.Ing 55 ° C, struktur sekunder RNA isih rumit banget, reverse transcriptase ora bisa digunakake, lan struktur sekunder ora bisa rampung nganti 65 ° C, dene suhu optimal AMV lan M-MLV luwih murah tinimbang suhu iki.
apa sing kudu dilakoni?Struktur sekunder minangka pasangan pelengkap saka cithakan kasebut, sing ndadékaké kompetisi sing kuat ing antarané primer lan transcriptase mbalikke lan cithakan, sing nyebabake sawetara masalah kayata E kurang lan bisa diulang.

apa sing kudu dilakoni?Mung nambah suhu anil sabisa.

Akeh pabrikan reagen nambah transkripase terbalik liwat rekayasa genetika.Sawetara nambah suhu reaksi, kayata Jifan lan Aidelai, lan sawetara mbusak klompok aktif enzim RNase H kanggo nambah karemenan antarane enzim lan cithakan RNA.Karemenan dhuwur bisa kompetitif remet metu struktur secondary lan maca liwat lancar, lan uga nemen nambah efficiency transkripsi mbalikke.
Titik kunci: Transkripsi mbalikke luwih penting kanggo ngupayakake konsistensi efisiensi transkripsi mbalikke (enzim kudu ora mung efisien nanging uga stabil), tinimbang jumlah sampel sing dimuat, yen ora PCR kuantitatif fluoresensi skala gedhe, ora bakal bisa ditindakake.Multiple cDNA.
Various manufaktur uga wis digawe sawetara efforts ing nguber konsistensi.Contone, umume perusahaan saiki wis ngrangkep transkripsi mbalikke minangka kit standar sing didol, sing dadi pilihan sing apik.
Contone, kit Foregene's RT Easy Series:

RT Easy I (Master premix kanggo kit sintesis cDNA untai pertama)

MIQE (5) - informasi gen target

Tokoh ing ndhuwur nerangake
1. Apa gen iki efektif kanggo eksperimen bola-bali umume bisa diverifikasi kanthi eksperimen bola-bali.
2. Gen ID, sampeyan ngerti.
3. Panjang gen, panjang total gen target mesthi ora masalah.Nalika ngrancang primer, priksa manawa dawa amplicon ing antarane 80-200bp kanggo njamin efisiensi amplifikasi sing luwih apik.
4. Sequence Blast informasi comparison, gen target kudu dibandhingake ing bank gene kanggo nyegah amplifikasi non-spesifik.
5. Anane pseudogenes.Pseudogene minangka urutan DNA sing padha karo gen normal nanging ilang fungsi normal.Asring ana ing kulawarga multi-gen eukariota.Biasane diwakili dening ψ.Iki minangka salinan DNA genom non-fungsi ing genom sing meh padha karo urutan gen pengkodean., umume ora ditranskripsi, lan ora nduweni makna fisiologis sing jelas.
6. Posisi primer relatif marang ekson lan intron.Ing taun-taun awal, nalika kita ngrampungake masalah kontaminasi DNA, kita kerep menehi perhatian marang posisi primer, ekson, lan intron, lan umume dianggep ngrancang primer ngliwati intron supaya ora amplifikasi DNA.Deleng gambar ing ngisor iki: ireng nggambarake intron, macem-macem biru nggambarake ekson, jambon nggambarake primer umum, lan abang padhang nggambarake primer sing kalebu intron.

Skema, ora tau bener
Apa rencana sing sampurna iki katon, nanging nyatane, ing pirang-pirang kasus, primer trans-intron ora kaya sing dibayangake, lan uga bakal nyebabake amplifikasi sing ora spesifik.Dadi cara sing paling apik kanggo nyegah kontaminasi DNA yaiku mbusak DNA kanthi lengkap.
7. Prediksi konformasi.Nggunakake conto iki maneh, gunakake alat online mFold kanggo nemtokake struktur sekunder saka fragmen target ing suhu lan konsentrasi uyah tartamtu.

Struktur sekunder RNA ing suhu sing beda
Struktur sekunder punika pasangan pelengkap saka cithakan dhewe, kang bakal mimpin kanggo kompetisi kuwat antarane sepisanan lan pasangan Cithakan, lan kemungkinan saka sepisanan naleni kurang, asil ing seri masalah kayata E kurang lan repeatability miskin.Liwat prediksi piranti lunak, yen ora ana masalah struktur sekunder, mesthi apik banget.Yen ana, artikel tindak lanjut kita bakal ngrembug babagan cara ngatasi masalah iki.

MIQE (6)—qPCR Oligonukleotida

Kanggo PCR kuantitatif fluoresensi, perkara pisanan sing sampeyan lakoni saben dina yaiku ekstraksi RNA, lan sing nomer loro yaiku desain primer.
Kaping pisanan, kita isih mriksa aturan babagan desain primer miturut dhaptar mriksa MIQE.Gampang banget yen scumbags bisa ngguyu, lan kita bisa ngrampungake ing siji ukara: ngerteni urutan lan posisi probe primer lan cara modifikasi.Kanggo metode purifikasi primer, sintesis primer saiki murah banget, qPCR pantes kanggo metode pemurnian PAGE lan ndhuwur, lan informasi instrumen sintesis ora penting.Akeh wong sing wis nindakake primer sajrone pirang-pirang dekade lan ora ngerti manawa synthesizer kasebut yaiku ABI3900.
Babagan prinsip desain sepisanan, sampeyan ora kudu ngeling-eling kanthi ngeling-eling, amarga umume piranti lunak desain primer utawa alat online bisa ngatasi masalah kasebut (alat online sing dianjurake primer3.ut.ee/), lan 99,999% desain primer ora ditindakake kanthi manual Deleng, penulis kadhangkala ngrancang atusan primer saben dina, yen maca siji-sijine bakal dadi mata silang.
Cukup priksa titik ing ngisor iki sawise primer dirancang:
1. Desain primer sing cedhak karo mburi 3′: Ing kasus nggunakake primer oligo dT kanggo sintesis untaian pertama cDNA, ngelingi efisiensi transkripsi terbalik lan integritas RNA, primer sing dirancang kudu dirancang cedhak karo mburi 3′ kanggo nambah efisiensi amplifikasi.Gunakake gambar kanggo nerangake kaya ing ngisor iki (ora ana cara kanggo mangerteni iki):

Apa kudu primers dirancang cedhak 3′ mburi, iku kudu ora bener
2. Nilai TM: Nilai Tm ana ing 55-65 ° C (amarga aktivitas exonuclease paling dhuwur ing 60 ° C), lan isi GC ana ing 40% -60%.
3. BLAST: Kanggo ngindhari amplifikasi genom sing ora spesifik, Blast kudu digunakake kanggo verifikasi tambahan.

MIQE(7)—proses qPCR

1. qPCR kit
Miturut syarat MIQE, kita kudu njlèntrèhaké kanthi jelas kahanan reaksi lengkap ing artikel kasebut, kalebu konfigurasi sistem reaksi PCR, kit apa sing digunakake, sapa pabrikan, sepira gedhene sistem reaksi, apa cara pewarna utawa metode probe digunakake, setelan program PCR.Pembalap Veteran mesthi bakal nemokake manawa kit kasebut dipilih, informasi ing ndhuwur ditemtokake.
Saiki, pabrikan lan produksi kit PCR kuantitatif fluoresensi minangka teknologi sing diwasa banget.Yen sampeyan ora milih produsen sing ala banget, kemungkinan masalah ora dhuwur, nanging kita isih pengin nuduhake sawetara poin:
Enzim Taq wiwitan panas:Sisih paling penting saka PCR yaiku enzim Taq wiwitan panas.Enzim wiwitan panas ing pasar umume dipérang dadi rong jinis, siji yaiku enzim wiwitan panas sing diowahi kanthi kimia (sampeyan bisa mbayangno minangka paraffin embedding), lan liyane yaiku enzim wiwitan panas kanggo modifikasi antibodi (ikatan antigen-antibodi).Modifikasi kimia minangka cara awal enzim wiwitan panas.Nalika suhu tartamtu wis tekan, enzim bakal ngeculake aktivitase.Enzim wiwitan panas sing dimodifikasi antibodi nggunakake cara biologis kanggo ngalangi aktivitas enzim kasebut.Nalika suhu tartamtu wis tekan, antibodi bakal denatured lan ora aktif minangka protein, lan aktivitas enzim bakal digawa menyang muter.

Nanging, apa gunane iki?Ing kasus iki, aktivitas rilis enzim sing diowahi antibodi luwih cepet tinimbang enzim sing diowahi kanthi kimia, mula saka segi sensitivitas, enzim sing diowahi antibodi duwe kauntungan sing sithik, saengga ora ana enzim sing diowahi sacara kimia ing kit ing pasar.Yen ana, teknologi pabrikan iki isih macet ing jaman milenium.
Konsentrasi ion Magnesium:Konsentrasi ion magnesium penting banget ing reaksi PCR.Konsentrasi ion magnesium sing cocog bisa ningkatake aktivitas enzim Taq.Yen konsentrasi banget kurang, aktivitas enzim bakal suda sacara signifikan;yen konsentrasi dhuwur banget, amplifikasi non-spesifik katalis enzim bakal ditingkatake.Konsentrasi ion magnesium uga bakal mengaruhi anil saka primer, suhu leleh saka cithakan lan produk PCR, saéngga mengaruhi asil pecahan amplified.Konsentrasi ion magnesium umume dikontrol ing 25mM.Mesthine, kanggo kit sing apik, konsentrasi ion magnesium kudu dikontrol kanthi apik.Sawetara pedagang nambah agen chelating ion magnesium menyang reagen, sing bisa entuk efek penyesuaian otomatis konsentrasi ion magnesium.
Konsentrasi pewarna neon:Pewarna fluoresensi, yaiku SYBR Green sing biasane digunakake, utamane ngasilake fluoresensi kanthi ngiket menyang alur suntingan DNA untai ganda, amarga pengikatan pewarna menyang DNA untai ganda ora spesifik, yaiku yen DNA untai ganda digabungake karo DNA untai ganda, fluoresensi bisa dadi sinyal ing latar mburi lan bakal mbentuk sinyal DNA ing latar mburi.
PS: Amarga sifat sensitif cahya, produk ing pasar umume dikemas ing tabung centrifuge opaque coklat (kaya sing ditampilake ing gambar ing ngisor iki).Nanging, iki bakal nemoni masalah.Iku angel kanggo ndeleng apa Cairan di sedot nalika sampling.Ing babagan iki, Qingke pancen paling pangguna-loropaken (minangka ditampilake ing gambar ngisor), lan tabung transparent wis rangkep ing tas timah opaque.Banjur dilebokake ing tas timah, kanthi nggatekake kenyamanan kanggo nyegah cahya lan sampling.Sampeyan kudu milih nomer produk tengen.TSE204 punika eksistensi super biaya-efektif, kang ndadekake kula pengin nandur suket.

Konsentrasi pewarna fluoresensi uga penting banget.Yen konsentrasi banget kurang, kurva amplifikasi ora bakal munggah ing tahap sabanjure lan ora sampurna;yen konsentrasi dhuwur banget, bakal nimbulaké gangguan gangguan.Wiwit PCR kuantitatif neon utamane gumantung marang nilai CT, yen konsentrasi pewarna neon ora diatur kanthi bener, titik sing kurang luwih apik tinimbang titik sing dhuwur.Mesthine, konsentrasi pewarna sing cocog yaiku sing paling apik.

ROX: Pewarna ROX digunakake kanggo mbenerake kesalahan sinyal fluoresensi sing apik.Sawetara manufaktur instrumen mbutuhake kalibrasi, dene liyane ora.Contone, panggunaan instrumen amplifikasi PCR Wektu Nyata Thermo Fisher Scientific biasane mbutuhake kalibrasi, kalebu 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, lsp. Instruksi kit umum bakal njlèntrèhaké.
Campuran qPCR Foregene uga ngemot pewarna ROX, sing trep digunakake ing macem-macem model.

Real Time PCR Kit-Taqman

Perawatan ikatan hidrogen sing lemah: Pangobatan ikatan hidrogen sing lemah minangka prakara sing relatif teknis.Ora ana sing maca manual akeh kit, nanging ora ana sing nyebutake topik iki.Nyatane, iku penting banget.Kombinasi basa utamané gumantung saka kekuatan ikatan hidrogen.Ikatan hidrogen kuwat minangka amplifikasi normal, lan ikatan hidrogen sing lemah nyebabake amplifikasi non-spesifik.Yen ikatan hidrogen sing lemah ora bisa diilangi kanthi apik, amplifikasi non-spesifik ora bisa dihindari.Ing ruang lingkup penulis, mung sawetara perusahaan sing ngerteni masalah iki.Nalika sampeyan tuku kit, sampeyan bisa ngrujuk apa sampeyan wis dianggep solusi ing gati kanggo kit sing arep milih.

Volume reaksi: Sistem 20-50ul luwih umum digunakake, lan volume cilik kamungkinan kanggo nimbulaké kasalahan.Umumé, instruksi kit bakal nyaranake nggunakake volume reaksi PCR.Aja pinter lan gunakake volume sing luwih cilik kanggo ngirit biaya.gol saka.Volume sing disaranake para pedagang wis diuji, lan bisa uga ora bisa ngatasi masalah kesalahan sing disebabake dening volume cilik.
2. Produsen lan nomer artikel saka piring tabung
Saben uwong ngerti prinsip PCR kuantitatif fluoresensi.Koleksi fluoresensi utamane ditindakake liwat tutup tabung PCR.Nalika milih PCR consumables, mbayar manungsa waé kanggo rong titik: transmisi cahya apik lan cocok kanggo instrument.Umumé, papan lan tabung merek utama apik, nanging sampeyan kudu milih kanthi ati-ati babagan adaptasi, yen ora, sampeyan ora bakal bisa nggunakake instrumen kasebut.

4. kawruh tingkat ndhuwur

MIQE (8)—validasi qPCR
Iki minangka prioritas utama qPCR!Dadi akeh pahlawan sing tiba ing pasir ing kene.Mesthi wae, sampeyan uga bisa begja lan gen sing sampeyan sinau prasaja, mula sampeyan ngambang ing guwa es ing sadawane angin.Informasi verifikasi qPCR dimaksudake kanggo nguji linuwih data kasebut.Kita dhaptar informasi verifikasi sing dibutuhake kaya ing ngisor iki:

1. Tes spesifik
Spesifisitas amplifikasi gen target diuji kanthi mriksa manawa gambar elektroforesis minangka pita tunggal;verifikasi urutan;kurva leleh kanggo ndeleng yen peta puncak siji;verifikasi pencernaan enzim lan cara liyane.
Kene, kita fokus ing tanalisis amplifikasi non-spesifik nggunakake metode kurva leleh.Umumé, nalika kita ngrancang primer, ukuran pecahan produk kudu ana ing kisaran 80-200bp, sing ndadekake suhu leleh produk PCR 80-85 °C.Mulane, yen ana macem-macem puncak, kudu ana produk amplifikasi non-spesifik liyane;yen puncak katon ing ngisor 80 ° C, umume dianggep minangka dimer primer;yen puncak katon ing ndhuwur 85 ° C, umume dianggep minangka kontaminasi DNA utawa amplifikasi liyane nonspesifik saka pecahan gedhe.
Cathetan: Kadhangkala mung ana siji puncak ing 80 ° C.Ing wektu iki, konsep iki kudu dipatuhi.Kemungkinan asil amplifikasi kabeh dimer primer.

Kurva leleh normal (puncak tunggal tanpa amplifikasi non-spesifik)

Kurva leleh bermasalah (amplifikasi non-spesifik puncak palsu)
【Analisis kasus】

Ana puncak utama, nanging dimer primer serius
Kurva leleh siji-puncak ing gambar ing ngisor iki bisa gampang ngapusi mripatmu, mikir iku eksperimen sing sampurna, nanging asile pancen salah.Ing wektu iki, kita kudu ndeleng suhu leleh.Suhu puncak ing ngisor 80 ° C, sing bener-bener primer-dimer.

Ora ana fragmen target, kabeh dimer primer
Ing kene, kakangku ora bisa mandheg.Gambar ing ngisor iki minangka foto sing dijupuk nganggo ponsel sing dikirim menyang aku dening scumbag.Reagen sing digunakake kabeh merek sing umum digunakake ing industri.Dheweke diganti saka merek T-prefix menyang merek T-prefix liyane.Tak kira sampeyan wis ngira.Bajingan kasebut sesambat marang aku: "Reagen sing digunakake ing gambar pisanan apik banget, lan puncake tunggal.Mengko, sawise nggunakake reagen sing disaranake, dadi kaya gambar kapindho, kanthi puncak campuran.Sampeyan wis nggawe aku sengsara.“
Pisahake rong grafik kasebut.Sepisanan, siji duwe puncak siji, lan liyane duwe puncak kaping pindho.Omong kosong, puncak siji mesthi apik.Apa bener?
Luwih elek tinimbang Dou E, yen aku sijine loro gambar ing gambar ing ngisor iki, sampeyan bakal ngerti langsung.Nyatane, kita gampang lumpuh dening gambar kaya iki.Sawise analisis kanthi ati-ati, kita nemokake yen: puncak tokoh pisanan ing 75 ° C, sing rampung dimer primer;puncak saka tokoh kapindho katon ing 75 ° C lan 82 ° C, paling ana Produk katon.

Gambar umpan balik saka siswa
Dadi masalah dhasar dudu masalah reagen, nanging masalah desain primer.Ing wektu sing padha, uga mbuktekake manawa sawetara merek gedhe ora duwe kualitas wesi, lan uga mbuktekake apa sing diomongake sedulurku sadurunge: Ora merek reagen sing ndhukung artikel sampeyan.Iku artikel sampeyan sing ndhukung merek reagen.Bayangna wae, yen bajingan ora ngganti reagen, data sing salah bakal dikirim menyang jurnal, lan apa sing bakal kedadeyan bakal dadi tragedi.
2. Nilai Ct saka kontrol kosong
Aja nerangake, yen kontrol kosong duwe nilai Ct, apa ora polusi?Nanging, sampeyan isih kudu ngerti kontrol kosong sing duwe nilai Ct.Yen NTC, tegese ana DNA asing kayata kontaminasi reagen.Yen NRT, tegese RNA sing diekstrak duwe kontaminasi DNA.
3. Kurva standar
Kalebu rumus slope lan pitungan, efisiensi PCR bisa diitung liwat rumus.Eksperimen sing sampurna mbutuhake kemiringan kurva standar kanggo nyedhaki 3,32, lan R² nyedhaki 0,9999.
4. Range dinamis linier
Rentang dinamis reaksi punika linier.Miturut cithakan sing digunakake kanggo ngasilake kurva standar, sawetara dinamis kudu kalebu paling ora 5 gradien konsentrasi, lan menehi perhatian marang owah-owahan nilai Ct ing gradien konsentrasi dhuwur lan gradien konsentrasi rendah.
5. Akurasi deteksi
Owah-owahan ing asil qPCR, yaiku, pengulangan sing kurang, yaiku, presisi sing kurang, disebabake dening akeh faktor, kalebu suhu, konsentrasi, lan operasi.Presisi qPCR umume dadi kurang bisa dikontrol amarga jumlah salinan suda.Saenipun variasi ing eksperimen, variasi teknis iki kudu beda karo variasi biologi, lan replika biologi bisa langsung ngatasi beda statistik ing asil qPCR antarane klompok utawa perawatan.Khusus kanggo tes diagnostik, presisi inter-assay paling apik (bisa diulang) ing situs lan operator kudu dilaporake.
6. Efisiensi deteksi lan LOD (ing multiplex qPCR)
LOD minangka konsentrasi paling murah saka 95% sampel positif sing dideteksi.Ing tembung liya, konsentrasi LOD sing ana ing sakumpulan replikasi gen target ora kudu ngluwihi 5% saka reaksi sing gagal.Nalika nindakake analisis qPCR multiplex, utamané kanggo deteksi simultaneous saka mutasi titik utawa polymorphisms, multiplex qPCR perlu kanggo nyedhiyani bukti sing akurasi sawetara pecahan target ora kompromi ing tabung padha, kaping deteksi lan siji tabung deteksi Efficiency lan LOD kudu padha.Utamane nalika gen target konsentrasi dhuwur lan gen target konsentrasi rendah digedhekake bebarengan, masalah iki kudu digatekake.
Masalah lan solusiUmumé, masalah sing asring ditemoni ing debugging qPCR fokus ing aspek ing ngisor iki:
· amplifikasi nonspesifik
· Pilihan angel konsentrasi primer lan masalah karo primer-dimer
· Suhu anil ora akurat
· Struktur sekunder mengaruhi efisiensi amplifikasi
amplifikasi nonspesifik
amplifikasi non-spesifikoccurs , umume dianggep manawa desain primer ora cocok, nanging yen sampeyan ora cepet-cepet ngganti primer, sampeyan bisa nyoba cara ing ngisor iki dhisik (prinsip kasebut uga dilampirake):
· Nambah suhu anil - nyoba nggawe ikatan hidrogen sing lemah ora bisa njaga;
· Nyepetake wektu annealing lan elongasi - nyuda kemungkinan ikatan hidrogen sing lemah;
· Nyuda konsentrasi primer - nyuda kemungkinan naleni primer sing berlebihan lan wilayah sing ora ditarget;
Efisiensi amplifikasi sing kurang
Kahanan ngelawan kanggo amplifikasi non-spesifik - efisiensi amplifikasi sing kurang, lan langkah-langkah kanggo ngatasi efisiensi amplifikasi sing kurang mung sebaliknya:
· Prolong wektu annealing lan elongation;
· Ganti PCR telung langkah lan nyuda suhu annealing;
· Tambah konsentrasi primer;
Ps: Akeh mahasiswa pascasarjana lair ing 90s ora gelem sinau carane debug nyobi, lan ngarep-arep sing kit bisa rampung ngatasi masalah (yen sampeyan pengin pindhah menyang perusahaan reagen kanggo nindakake riset lan pangembangan sawise lulus), nyatane, ing manufaktur reagen uga mikir cara iki, Mugi iku bodho Iku bisa digunakake nalika sampeyan njaluk iku, supaya reagens reagens kanggo ngatasi masalah, kalebu akeh gaweyan kanggo ngatasi masalah non-introduction. faktor penyerapan ikatan H lemah.Kanggo ngatasi masalah kanthi gampang, wong bodho isih kudu maca introduksi perusahaan reagen kanggo ndeleng manawa ana faktor sing nyerep ikatan hidrogen sing lemah.
Pilihan angel konsentrasi primer lan masalah karo primer-dimer
Cara 1: Umumé, instruksi kit kanggo qPCR wis dianjurake sistem lan dianjurake konsentrasi primer.
Cara 2: Debugging kanthi nyetel gradien konsentrasi primer.Gambar ing ngisor iki dicolong saka perusahaan kanggo ilustrasi.Gambar ing ngisor iki nuduhake asil kuantitatif fluoresensi digawe kanthi telung gradien konsentrasi primer (100nM, 250nM, 500nM) lan papat gradien konsentrasi template (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Nilai Ct saka asil eksperimen diplot kaya ing ngisor iki:

Seleksi Konsentrasi Primer Gabungke saben konsentrasi primer dadi baris kaya ing ngisor iki:

Pilihan konsentrasi primer jelas, hubungan linear konsentrasi primer 100nM lan 250nM luwih apik, lan hubungan linear konsentrasi primer 500nM relatif kurang.Ing 100nM lan 250nM, nilai Ct 250nM relatif cilik, saéngga konsentrasi primer optimal yaiku 250nM.Umume dimer primer sing abot bisa dideleng ing kurva leleh.Apa yen primer sing dirancang ora bisa nyegah dimer primer?
Cara 3: Ngurangi jumlah primer lan nambah suhu annealing (ora perlu nerangake).
Nilai empiris saka suhu anil yaiku 60 ° C.Yen sampeyan ora yakin, carane milih suhu annealing sing luwih cocok?Jawabane padha karo pilihan konsentrasi primer -tes gradient.Njupuk gambar saka perusahaan Bio-rad kanggo ilustrasi masalah.Kanggo amplifikasi fragmen target tartamtu, atur wolung gradien suhu, saben kanthi telung repetisi, lan kurva amplifikasi sing dipikolehi kaya ing ngisor iki:

pilihan suhu annealing:
· 70°C, 69°C—Sejatine, primer ora bisa digabung, mula ora ana amplifikasi.
· 67,3 ° C - Ana jumlah amplifikasi cilik ing wiwitan, lan nilai Ct relatif gedhe.
· 64,5°C——Nilai Ct suda.
· Ing 60,7 ° C, 58,0 ° C, 56,2 ° C, lan 55,0 ° C, nilai Ct dhasar cenderung stabil, nanging nilai fluoresensi pungkasan beda.
Carane milih?Prinsip: Prinsip pisanan yaiku nilai Ct sing luwih dhuwur.Kanggo nilai Ct sing padha, pilih suhu anil sing luwih dhuwur supaya ora dimerisasi lan amplifikasi non-spesifik.Sanajan ana nilai fluoresensi sing luwih dhuwur ing 55 ° C, bisa uga ana dimer utawa amplifikasi non-spesifik.
Nanging yen sampeyan pinter kaya sampeyan, sampeyan mesthi bakal mikir: Secara logis, yen reaksi PCR spesifik banget, yen konsentrasi primer ngluwihi syarat minimal, titik dhuwur lan kurang kudu ora ana pengaruh, kaya pewarna fluoresensi lan dNTP.Pancen, anggere suhu anil dioptimalake kanthi bener, efek konsentrasi primer ing nilai Ct kanthi alami bakal diminimalisir.

Suhu anil dioptimalake kanthi bener, lan efek konsentrasi primer ing CT bakal diminimalisir
Struktur sekunder mengaruhi efisiensi amplifikasi
Ayo njupuk gambar saka Bio-rad kanggo ilustrasi masalah.Uga ngrancang gradien suhu kanggo nggedhekake gen kanthi struktur sekunder.

Struktur sekunder muncul
Bisa dideleng yen gradien suhu mudhun, produk wiwit katon lan nilai Ct maju, tekan nilai minimal ing 60,7 ° C, banjur minangka gradien suhu mudhun, nilai Ct dadi luwih gedhe.Kosok baline, nalika suhu mundhak, struktur sekunder mbukak lan efisiensi amplifikasi mundhak.Sawise tekan suhu tartamtu, nambah suhu ora bisa nambah efisiensi amplifikasi.Amarga primer ora bisa digabungake kanthi stabil ing wektu iki.Mulane,goleki suhu kanthi nilai Ct paling murah, yaiku suhu paling apik kanggo nggedhekake cithakan struktur sekunder!Mesthine, wong bodho sing pinter kudu ngerti yen ora perlu, luwih becik ngganti primer lan ngindhari wilayah struktur sekunder.
5. Tingkat aplikasi
MIQE—Analisis Data

Analisis data utamane diwenehake dening instrumen PCR kuantitatif fluoresensi.Ing artikel sadurunge, akeh karya analisis data sing wis ditindakake, kayata kontrol kosong, sing wis diterangake ing desain eksperimen.Gen referensi internal, nomer ulang, lan liya-liyane wis diklarifikasi., kene kita utamané nerangake aplikasi saka qPCR.
qPCR digunakake akeh, lan verifikasi eksperimen lan diagnosis asam nukleat minangka skenario sing paling umum digunakake.
kuantifikasi absolut
Log (konsentrasi awal) nduweni hubungan linier karo jumlah siklus.Kurva standar bisa digambar saka standar kanthi nomer salinan awal sing dikenal, yaiku, hubungan linier reaksi amplifikasi bisa diduweni.Miturut nilai Ct saka sampel, konsentrasi ing sampel bisa diitung.Jumlah Cithakan kanggo kalebu.

Metode Petungan Kuantitatif Absolute
Kuantifikasi mutlak kudu adhedhasar kurva standar.Kanggo nggawe kurva standar, standar dibutuhake.Biasane, standar yaiku plasmid sing dipikolehi kanthi kloning gen target.Kenapa plasmid iku?Amarga DNA plasmid bunder paling stabil.Dilute produk standar ing 5 kanggo 6 gradients miturut rasio dobel (10-melu pencairan), lan mbayar manungsa waé kanggo uniformity nalika diluting.Ayo nilai Ct mudhun antarane 15-30.

Persiapan standar
Ing wektu sing padha, sampel sing bakal diuji uga kudu diencerke (elinga faktor pengenceran), lan nilai Ct uga kudu mudhun ing antarane 15-30.Produk standar + sampel sing bakal diuji dilebokake ing mesin bebarengan.Sawise mlayu, kurva standar digawe karo zat standar, lan conto sing bakal diuji digawa menyang kurva standar kanggo ngitung konsentrasi.
Kuantifikasi HBV virus hepatitis B minangka kuantifikasi absolut sing khas, sing bisa ngetung nomer salinan virus ing 1ml getih.
Pitungan nomer salinan
Konsentrasi sampel yang akan diuji (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × faktor pengenceran
Bobot molekul sampel = jumlah basa × 324
Nomer salinan sampel sing bakal diuji (salinan/ul) = konsentrasi sampel sing bakal diuji / bobot molekul sampel × 6 × 1014

Cara pitungan nomer salinan

Ing ndhuwur minangka cara pitungan kanggo nemtokake jumlah.Iki masalah matematika sing bisa ditanggulangi sawise lulus saka SMP, lan masalah matematika umume ditanggulangi dening komputer.Yen sampeyan ora ngerti, sampeyan bisa teka kanggo komunikasi.
kuantifikasi relatif
Kuantifikasi relatif utamané digunakake ing riset ilmiah.Pira virus ana ing 1ml getih, lan iku virus DNA, iki minangka acara sing relatif deterministik: jumlah getih bisa ditemtokake, lan virus DNA relatif stabil.Nanging, angel kanggo mbandhingake jumlah salinan transkripsi gen tartamtu ing godhong, amarga angel nemtokake ukuran, bobot, lan kelembutan godhong, jumlah RNA sing diekstrak angel ditemtokake, lan efisiensi transkripsi mbalikke uga angel ditemtokake, yaiku, langkah apa wae bisa nggawe data eksperimen duwe kewan omo lan ora bisa digunakake.
Mulane, kuantifikasi relatif kudu ngenalake unsur:gen referensi internal.
Ing tembung liya, kuantifikasi relatif minangka perbandingan antara gen target lan gen referensi internal.Dibandhingake ing jaringan sing padha lan sel sing padha, pengaruh ukuran sampel, jumlah ekstraksi RNA, efisiensi transkripsi terbalik, lan efisiensi PCR relatif cilik.Amarga ukuran sampel sing cilik, gen referensi internal lan gen target relatif suda.Mulane kita wis nandheske keseragaman lan stabilitas sadurunge.
Gen referensi internal umumegen omah( gen omah-omah), sing nuduhake kelas gen sing diwujudake kanthi stabil ing kabeh sel, lan produke perlu kanggo njaga aktivitas dhasar sel.
Aja bingung konsep iki.Gen housekeeping minangka istilah fungsi biologis, dene gen referensi internal minangka istilah teknis eksperimen.Gen housekeeping kudu lulus validasi sadurunge bisa dipilih minangka gen referensi internal.
Contone, kita milih sawetara gen housekeeping ing gambar ing ngisor iki kanggo nguji tingkat ekspresi ing sel jaringan sing beda-beda, lan nemokake yen tingkat ekspresi β-2-microglobulin cukup beda karo telung gen liyane, saengga ora bisa digunakake minangka gen referensi internal.

Sawise mangerteni fungsi koreksi saka gen referensi internal, loro algoritma diturunake amarga introduksi gen referensi internal.
· Metode kurva standar ganda
·2 – △△Metode Ct (metode perbandingan nilai CT)
Yen sampeyan kasengsem ing sinau spesies lan fungsi gen, please nyerah riset ing algoritma lan nggunakake rumus langsung, utawa nggunakake mesin langsung;yen sampeyan wong lurus ing matématika lan teknik, please aran gratis.
metode kurva standar ganda
Jumlah gen target lan gen housekeeping saka sampel kontrol lan sampel kanggo dites liwat kurva standar, banjur ngetung nilai relatif miturut rumus pitungan, kang tingkat expression relatif.
Kaluwihan: analisis prasaja, optimasi eksperimen sing relatif prasaja
Kakurangan: Kanggo saben gen, saben babak eksperimen kudu nggawe kurva standar
Aplikasi: Salah siji saka rong cara kuantitatif relatif sing paling umum digunakake lan dikenali ing sinau regulasi ekspresi gen
Rumus kasebut kaya ing ngisor iki:

Tuladhane kaya ing ngisor iki:

Etung jumlah relatif adhedhasar asil kuantitatif
2 – △△Metode Ct (metode perbandingan nilai CT)

Kaluwihan: Ora perlu nggawe kurva standar
Cacat: Dianggep efisiensi amplifikasi cedhak 100%;simpangan baku <5%, lan kurva standar lan efisiensi antarane saben amplifikasi dianggep konsisten;optimasi kahanan eksperimen luwih rumit.
Aplikasi: Salah siji saka rong cara kuantitatif relatif sing paling umum digunakake lan dikenali ing sinau regulasi ekspresi gen

Mesthine, efisiensi amplifikasi biasane ora bisa sampurna 1. Cara koreksi: Yen kita ngerti yen gen target lan gen referensi duwe efisiensi amplifikasi sing padha, nanging efisiensi amplifikasi ora padha karo 1, banjur 2－△△Ct bisa didandani minangka: (1+E)－△△Ct0.lifications bisa dadi rumus kanggo amplifikasi, contone, rumus Ct0. 1.95－△△Ct
Nganti saiki, konten babagan PCR kuantitatif fluoresensi wis rampung.