Dikenal manawa ing dogma tengah, RNA minangka mediator transkripsi antarane DNA lan ekspresi protein.Dibandhingake karo deteksi DNA, deteksi RNA bisa luwih objektif nggambarake ekspresi gen ing organisme.Eksperimen sing nglibatake RNA kalebu: qRT-PCR, RNA-Seq, lan deteksi gen fusi, lan liya-liyane. Adhedhasar karakteristik RNA dhewe (cincin gula RNA duwe gugus hidroksil luwih bebas tinimbang cincin gula DNA), ditambah karo jumlah RNase sing akeh ing lingkungan, RNA luwih ora stabil lan luwih gampang didegradasi tinimbang DNA.Sampah mlebu, uwuh metu, yen kualitas RNA ora apik, banjur asil eksperimen kudu ora puas, khusus diwujudake minangka data sing ora akurat utawa pengulangan sing kurang.Mulane, luwih akeh perhatian kudu dibayar kanggo pangolahan RNA, lan link kontrol kualitas uga luwih penting kanggo njamin presisi lan akurasi data eksperimen sakteruse.

Kanggo kontrol kualitas RNA, umume ana cara sing umum digunakake ing ngisor iki:

• Spektrofotometri
• elektroforesis gel agarose
• Agilent Bioanalyzer
• PCR kuantitatif fluoresensi nyata-wektu
• Metode pewarna fluoresen Qubit

01 Spektrofotometri

RNA duwé ikatan rangkap konjugasi lan duwé puncak panyerepan kanthi dawa gelombang 260nm.Miturut hukum Lambert-Beer, kita bisa ngetung konsentrasi RNA saka puncak panyerepan ing 260nm.Kajaba iku, kita uga bisa ngetung kemurnian RNA miturut rasio puncak panyerepan 260nm, 280nm lan 230nm.280nm lan 230nm minangka puncak panyerepan saka protein lan molekul cilik.Rasio A260 / A280 lan A260 / A230 saka kemurnian RNA sing berkualitas kudu luwih saka 2. Yen kurang saka 2, tegese ana kontaminasi protein utawa molekul cilik ing sampel RNA lan kudu diresiki maneh.Sumber kontaminasi bakal mengaruhi eksperimen hilir, kayata nyandhet efisiensi amplifikasi reaksi PCR, nyebabake asil kuantitatif sing ora akurat.Kemurnian RNA nduwe pengaruh gedhe ing asil sabanjure, mula spektrofotometri umume minangka tautan kontrol kualitas sing ora bisa dipisahake ing langkah pisanan ing eksperimen asam nukleat.

Gambar 1. Spektrum Penyerapan RNA/DNA Khas

02 Elektroforesis gel agarose

Saliyane kemurnian, integritas RNA uga minangka salah sawijining indikator penting kanggo nemtokake kualitas RNA.Degradasi RNA bakal nyebabake akeh pecahan cendhak ing sampel, saengga jumlah fragmen RNA sing bisa dideteksi kanthi efektif lan ditutupi dening urutan referensi bakal suda.Integritas RNA bisa dipriksa kanthi elektroforesis total RNA ing gel agarose 1%.Cara iki bisa ngatur gel dhewe, utawa nggunakake Sistem E-Gel™ prefabrikasi kanggo tes integritas.Luwih saka 80% saka total RNA yaiku RNA ribosom, sing mayoritas kasusun saka 28S lan 18S rRNA (ing sistem mamalia).RNA kualitas apik bakal nuduhake loro bar padhang ketok, kang 28S lan 18S bar padhang, mungguh, ing 5 Kb lan 2 Kb, lan rasio bakal kathah cedhak 2:1.Yen ana ing negara sing nyebar, tegese sampel RNA bisa uga wis rusak, lan disaranake nggunakake metode sing diterangake mengko kanggo nguji kualitas RNA.

Gambar 2. Perbandingan degradasi (jalur 2) lan RNA utuh (jalur 3) ing elektroforesis gel agarose

03 Agilent Bioanalyzer

Saliyane metode elektroforesis gel agarose sing kasebut ing ndhuwur, sing bisa mbantu ngenali integritas RNA kanthi gampang lan cepet, kita uga bisa nggunakake bioanalyzer Agilent kanggo nemtokake integritas RNA.Iki nggunakake kombinasi mikrofluida, elektroforesis kapiler, lan fluoresensi kanggo netepake konsentrasi lan integritas RNA.Kanthi nggunakake algoritma sing dibangun kanggo nganalisa profil sampel RNA, bioanalyzer Agilent bisa ngetung nilai integritas RNA referensi, Nomer Integritas RNA (sabanjuré diarani RIN) [1].Sing luwih gedhe nilai RIN, luwih dhuwur integritas RNA (1 banget rusak, 10 paling lengkap).Sawetara eksperimen nglibatake RNA nyaranake nggunakake RIN minangka parameter kanggo penilaian kualitas.Njupuk eksperimen sequencing dhuwur-throughput (sabanjuré diarani NGS) minangka conto, pedoman Oncomine ™ Human Immune Repertoire, sing digunakake kanggo ndeteksi sel B lan reseptor antigen sel T ing seri panel Oncomine Thermo Fisher, nyaranake yen sampel kanthi nilai RIN luwih saka 4, Wacan lan klon sing luwih efektif bisa diukur 3 (Gambar 3).Ana macem-macem kisaran sing disaranake kanggo panel sing beda-beda, lan asring RIN sing luwih dhuwur bisa nggawa data sing luwih efektif.

Gambar 3, ing eksperimen Oncomine™ Human Immune Repertoire, conto kanthi RIN luwih saka 4 bisa ndeteksi maca sing luwih efektif lan klon sel T.【2】

Nanging, nilai RIN uga duwe sawetara watesan.Senajan RIN nduweni korélasi dhuwur karo kualitas data eksperimen NGS, nanging ora cocok kanggo conto FFPE.Sampel FFPE wis diolah kanthi kimia kanggo wektu sing suwe, lan RNA sing diekstrak umume nduweni nilai RIN sing relatif murah.Nanging, iki ora ateges manawa data eksperimen sing efektif kudu ora kepenak.Kanggo nemtokake kualitas sampel FFPE kanthi akurat, kita kudu nggunakake pangukuran liyane saka RIN.Saliyane RIN, bioanalyzer Agilent uga bisa ngetung nilai DV200 minangka parameter evaluasi kualitas RNA.DV200 minangka parameter sing ngitung proporsi fragmen sing luwih gedhe tinimbang 200 bp ing sampel RNA.DV200 minangka indikator kualitas sampel FFPE sing luwih apik tinimbang RIN.Kanggo RNA sing diekstrak dening FFPE, nduweni korélasi sing dhuwur banget karo jumlah gen sing bisa dideteksi kanthi efektif lan keragaman gen [3].Sanajan DV200 bisa ngrampungake kekurangan ing deteksi kualitas FFPE, bioanalyzer Agilent isih ora bisa nganalisa masalah kualitas ing conto RNA kanthi lengkap, kalebu manawa ana inhibitor ing conto kasebut.Inhibitor dhewe bisa mengaruhi efisiensi amplifikasi eksperimen hilir lan nyuda jumlah data sing migunani.Kanggo ngerti apa ana inhibitor ing sampel, kita bisa nggunakake metode PCR kuantitatif neon nyata-nyata sing diterangake ing ngisor iki.

04 PCR kuantitatif fluoresensi nyata-wektu

Cara PCR kuantitatif neon nyata ora mung bisa ndeteksi inhibitor ing sampel, nanging uga nggambarake kualitas RNA ing sampel FFPE kanthi akurat.Dibandhingake karo analisa biologi Agilent, instrumen kuantitatif fluoresensi wektu nyata luwih populer ing laboratorium biologi utama amarga aplikasi sing luwih akeh.Kanggo nguji kualitas sampel RNA, kita mung kudu tuku utawa nyiapake probe primer kanggo gen referensi internal, kayata GUSB (Cat no. Hs00939627).Kanthi nggunakake set primer, probe lan standar iki (total RNA saka konsentrasi sing dikawruhi) kanggo nindakake eksperimen kuantitatif absolut, konsentrasi pecahan RNA sing efektif bisa diitung minangka standar evaluasi kualitas RNA (Functional RNA Quantitation (FRQ) kanggo cendhak).Ing tes NGS, kita nemokake manawa FRQ saka conto RNA nduweni korélasi sing dhuwur banget karo volume data sing efektif.Kanggo kabeh conto luwih saka 0,2ng / uL FRQ, paling 70% saka maca bisa èfèktif nutupi urutan referensi (Figure 4).

Gambar 4, nilai FRQ sing dideteksi kanthi metode kuantitatif fluoresensi nduweni korelasi sing dhuwur banget (R2> 0.9) kanthi data efektif sing dipikolehi ing eksperimen NGS.Garis abang minangka nilai FRQ sing padha karo 0,2 ng / uL (log10 = -0,7).【4】

Saliyane ditrapake kanggo conto FFPE, metode PCR kuantitatif wektu nyata uga bisa ngawasi inhibitor kanthi efektif ing conto.Kita bisa nambah sampel sing bakal dideteksi menyang sistem reaksi kanthi Kontrol Positif Internal (IPC) lan Assay, banjur nindakake kuantifikasi fluoresensi kanggo entuk nilai Ct.Yen nilai Ct lags konco Nilai Ct ing reaksi ora sampel, iku nuduhake yen inhibitor ana ing sampel lan nyandhet efficiency amplifikasi ing reaksi.

05 Qubit metode pewarna fluoresensi

Qubit Fluorometer minangka piranti cilik sing paling umum digunakake kanggo konsentrasi asam nukleat lan deteksi kemurnian, sing gampang dioperasikake lan ana ing meh kabeh laboratorium biologi molekuler.Iku kanthi akurat ngetung konsentrasi asam nukleat kanthi ndeteksi lan pewarna fluoresensi pengikat asam nukleat (reagen deteksi Qubit).Qubit nduweni sensitivitas lan kekhususan sing dhuwur, lan bisa ngetung RNA kanthi akurat nganti konsentrasi pg/μL.Saliyane kemampuan kondhang kanggo ngitung konsentrasi asam nukleat kanthi akurat, model anyar Thermo Fisher paling anyar, Qubit 4.0, uga bisa ndeteksi integritas RNA.Sistem deteksi RNA Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) ndeteksi integritas RNA kanthi bebarengan ndeteksi rong pewarna fluoresensi spesifik.Loro pewarna neon iki bisa ngiket pecahan gedhe lan pecahan cilik RNA.Loro pewarna neon iki nuduhake proporsi pecahan gedhe saka RNA ing sampel, lan saka iki nilai IQ (Integritas lan Kualitas) sing nuduhake kualitas RNA bisa diitung.Nilai IQ ditrapake kanggo conto FFPE lan non-FFPE, lan nduweni pengaruh gedhe ing kualitas urutan sakteruse.Njupuk eksperimen NGS minangka conto, ing eksperimen tes RNA-Seq sing ditindakake ing platform Ion torrent™, umume conto kanthi nilai IQ luwih saka 4 duwe paling ora 50% wacan efektif (Gambar 5).Dibandhingake karo cara deteksi ndhuwur-kasebut, Qubit IQ Assay ora mung luwih trep kanggo operate lan njupuk wektu kurang (ing limang menit), nanging uga wis korélasi gedhe antarane nilai IQ parameter diukur lan kualitas data saka eksperimen hilir.

Figure 5, ana korélasi gedhe antarane nilai Qubit RNA IQ lan maca peta saka RNA-Seq.【5】

Liwat introduksi ing ndhuwur, aku percaya yen saben wong duwe pangerten sing cukup babagan cara kontrol kualitas RNA sing beda.Ing laku, sampeyan bisa milihcara sing cocog miturut jinis sampel lan instrumen sing ana.Mung kanthi ngontrol kualitas RNA kanthi apik, kita bisa ngindhari kegagalan eksperimen sakteruse sing disebabake kualitas sampel sing kurang apik, saéngga ngirit wektu, energi lan biaya sing larang.

Produk referensi:

Kit Isolasi RNA Total Kewan

Kit Isolasi RNA Total Sel

referensi

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: nomer integritas RNA kanggo nemtokake nilai integritas kanggo pangukuran RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https://doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire Pandhuan Panganggo (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Metrik Kualitas Ditingkatkan kanggo Menilai RNA Diturunake Saka Arsip Sampel Tisu Disemat Parafin Ditempelake Formalin, Ilmu Toksikologi, Volume 170, Edisi 3, Agustus 3https://doi.org/10.1093/toxsci/