Eksperimen RT-qPCR kalebu ekstraksi RNA lan penilaian kualitas, transkripsi mbalikke lan qPCR telung langkah, saben langkah wis akeh pancegahan, kita bakal ngenalake kanthi rinci ing ngisor iki.

Ⅰ.Evaluasi kualitas RNA

Ing eksperimen RT-qPCR, sawise rampung ekstraksi RNA, kualitas RNA kudu dievaluasi, lan eksperimen tindakake mung bisa ditindakake sawise kualifikasi.Cara evaluasi kalebu spektrofotometer, elektroforesis gel Agilent, analisis Agilent 2100, ing antarane spektrofotometer sing paling umum digunakake lan deteksi metode elektroforesis gel agarose.Perlu dicathet yen rong cara kasebut kudu digunakake bebarengan kanggo ngrampungake deteksi lan analisis konsentrasi, kemurnian lan integritas RNA, supaya bisa njamin kualitas RNA.

Kit Isolasi RNA sing gegandhengan: 

Kit Isolasi RNA Total Sel

RNA total sing diresiki lan berkualitas tinggi bisa dipikolehi saka macem-macem sel kultur sajrone 11 menit.

Kit Isolasi RNA Total Kewan

Cepet lan efisien extract RNA total kemurnian lan kualitas dhuwur saka macem-macem jaringan kewan.

Spektrofotometer:

Spektrofotometer utamane digunakake kanggo nemtokake konsentrasi lan kemurnian RNA, nanging ora bisa ndeteksi integritas RNA lan residu genom.Antarane, A260/280 lan A260/230 minangka parameter penting kanggo deteksi kemurnian RNA, lan kemurnian RNA bisa dideteksi miturut fluktuasi nilai kasebut:

1. 1.9< A260/280< 2.1, nuduhake yen kemurnian RNA apik;A260/280<1.9, nuduhake yen ana residu protein ing RNA;A260 / 280> 2.1, nuduhake kemungkinan degradasi parsial RNA, sing bisa dikonfirmasi kanthi elektroforesis gel agarose.

2. 2.0 < A260 / 230 < 2.2, nuduhake yen kemurnian RNA apik;A260/230< 2.0, nuduhake yen ana residu reagen organik ing RNA, kayata fenol, etanol utawa gula.

Elektroforesis gel agarose:

Uji elektroforesis gel agarose bisa nganalisa integritas RNA, genom lan residu protein, nanging ora bisa ngitung konsentrasi RNA kanthi akurat utawa ndeteksi residu reagen organik.Coba conto RNA eukariotik:

1. RNA kena elektroforesis gel agarose.Yen mung ana telung pita tunggal 28sRNA, 18sRNA lan 5.8sRNA ing peta gel, iki nuduhake yen RNA sing diekstrak isih utuh.Yen ana fenomena nyeret, iki nuduhake degradasi parsial RNA.

2. Yen ana pita padhang siji ing antarane bolongan lim lan pita 28sRNA, bisa uga ana residu DNA genomik.

3. Yen pita katon ing bolongan lim, nuduhake yen ana residu protein lan zat makromolekul liyane.

Ⅱ. Transkripsi mbalikke

Sawise ekstraksi RNA rampung, perlu dibalikake dadi cDNA kanggo eksperimen sabanjure, mula langkah pembalikan iku penting.Transkripsi terbalik bakal dienalake saka pilihan reverse transcriptase lan primer:

Pilihan reverse transcriptase:

Transkripase terbalik sing khas kalebu AMV RTase lan MMLV RTase.RNase H saka AMV RTase nduweni aktivitas kuwat, dawa sintesis cendhak, jumlah sintesis kurang lan stabilitas termal apik (42 ~ 55 ℃).Aktivitas RNase H saka MMLV RTase lemah, dawa sintesis dawa, jumlah sintesis dhuwur, lan stabilitas termal kurang (37 ~ 42 ℃).

Amarga enzim RNase H nduweni fungsi ngrusak cithakan RNA, MMLV kanthi aktivitas RNase H sing lemah kudu dipilih luwih disenengi sajrone transkripsi mbalikke, lan sawise rekayasa genetika mengko, stabilitas termal MMLV wis tekan lompatan kualitatif.Njupuk ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV kanggo transkripsi terbalik) minangka conto, iku transcriptase mbalikke anyar ditulis ing bakteri direkayasa E. coli nggunakake teknologi rekombinasi genetis.Iki minangka polimerase DNA rekombinan sing nyintesis untaian DNA komplementer saka RNA untai tunggal, DNA, utawa hibrida RNA:DNA.Ora duwe aktivitas RNase H, stabilitas sing kuat, afinitas RNA sing kuwat, lan sensitivitas deteksi dhuwur.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV kanggo transkripsi terbalik)

Pilihan primer:

Umume primer RT dadi telung kategori: oligo dT, primer acak, lan primer spesifik gen.Pilih primer sing cocog kanggo digunakake miturut syarat eksperimen sing beda.

1. Yen cithakan asale saka eukariotik lan cDNA pungkasan digunakake kanggo amplifikasi PCR rutin, dianjurake Oligo (dT);Yen eksperimen sakteruse mung digunakake kanggo qPCR, Oligo (dT) dianjurake kanggo dicampur karo primer acak kanggo nambah efisiensi transkripsi mbalikke.

2. Yen cithakan saka prokariota, Random Primer utawa gen spesifik primer kudu dipilih kanggo transkripsi mbalikke.

Ⅲ.qPCR

Kuantifikasi fluoresensi utamane dijlentrehake saka pilihan metode kuantitatif, prinsip desain primer, pilihan ROX, konfigurasi sistem reaksi lan setelan kahanan reaksi, lsp.

Pemilihan metode kuantitatif:

Metode kuantitatif diperang dadi metode kuantitatif relatif lan metode kuantitatif absolut.Kuantifikasi relatif bisa digunakake kanggo ndeteksi efek cara perawatan tartamtu ing ekspresi gen, ndeteksi prabédan ekspresi gen ing wektu sing beda-beda lan mbandhingake prabédan ekspresi gen ing jaringan sing beda-beda.Kuantifikasi absolut bisa ndeteksi jumlah asam nukleat ing virus lan liya-liyane.Nalika nindakake eksperimen, kita kudu milih metode kuantitatif sing cocog miturut eksperimen kita dhewe.

Prinsip desain dhasar:

Desain primer kanggo qPCR langsung ana hubungane karo efisiensi amplifikasi lan spesifik produk.Mulane, kanthi bener ngrancang primer sing apik minangka langkah pisanan saka qPCR sing sukses.Ing desain primer, prinsip-prinsip ing ngisor iki kudu digatekake nalika ketemu prinsip desain primer konvensional:

1. Dawane fragmen target dikontrol antarane 100 lan 300 bp;

2. Desain cross-exon kanggo ngindhari pengaruh DNA genom;

3. Primer sing dirancang kudu diuji kanggo efisiensi amplifikasi, lan mung nalika efisiensi amplifikasi tekan standar (90-110%), bisa digunakake kanggo eksperimen kuantitatif;

4. konsentrasi Primer biasane optimized antarane 0.1uM lan 1.0uM.

Pilihan sakaROX:

Ing proses reaksi kuantitatif, ROX bisa nyetel prabédan path optik, kesalahan pipetting utawa prabédan volume disebabake penguapan lan kondensasi seragam, Ngapikake repeatability saka asil.Nanging, kudu dicathet yen pilihan ROX ana gandhengane karo instrumen kasebut.Yen instrumen qPCR nduweni fungsi kanthi otomatis mbenerake beda antarane bolongan, ora perlu nambah ROX;yen ora, perlu nambah koreksi ROX.Mitra cilik kanggo tuku reagen kudu miturut instrumen sing digunakake kanggo milih ROX sing bener, supaya ora ana kesalahan mengko.

Persiapan sistem reaksi:

Volume reaksi 20ul lan 50ul luwih disenengi.Prakara ing ngisor iki kudu digatekake nalika nggawe sistem:

1. Sistem reaksi kudu disiapake kanthi ventilasi ing meja kerja ultra-resik, ddH anyar₂O digunakake kanggo saben eksperimen;

2. Saben eksperimen kudu nyiapake NTC kanggo verifikasi manawa ana polusi ing sistem, lan saben pasangan primer kudu nindakake NTC nalika nyiapake sistem;

3. Kanggo ndeteksi apa ana residu gDNA ing cithakan RNA, NRT bisa disiapake kanggo saben sampel kanggo deteksi;

4. Nalika nyiapake sistem, dianjurake kanggo nindakake paling ora 3 ulang teknis kanggo siji sampel;

5. Nalika cithakan cDNA, dianjurake kanggo dilute 5-10 kaping kanggo ngurangi efek inhibisi sistem transkripsi mbalikke ing eksperimen qPCR.Iku luwih apik kanggo njelajah jumlah cithakan dening gradient, supaya Nilai CT tumiba antarane 20-30;

6. Nemtokake jumlah reaksi sing dibutuhake, nambah 5-10% adhedhasar jumlah reaksi, lan ngitung nomer konfigurasi volume;

7, sistem disiapake nggunakake prinsip premix, nyampur sawise centrifugation lan mesthekake ora umpluk;

8, Minangka adoh sabisa kanggo milih consumables ndhukung.

Kit RT-qPCR sing gegandhengan