Basis desain primer (99% masalah bisa dirampungake)
1. Dawane primer: Buku teks mbutuhake 15-30bp, biasane udakara 20bp.Kondisi nyata luwih apik dadi 18-24bp kanggo njamin kekhususan, nanging saya suwe saya suwe saya suwe, sepisanan sing dawa uga bakal nyuda spesifik, lan nyuda asil.
2. span amplifikasi Primer: 200-500bp cocok, lan pecahan bisa ditambahi kanggo 10kb ing kahanan tartamtu.
3. Dasar Primer: Isi G + C kudu 40-60%, banget sethitik efek amplifikasi G + C ora apik, kakehan G + C gampang katon band non-tartamtu.ATGC paling apik disebarake kanthi acak, ngindhari klompok luwih saka 5 purin utawa pirimidin nukleotida.Multi-gc kanggo 5 'akhir lan urutan penengah kanggo nambah stabilitas, supaya GC sugih ing 3' mburi, ora GC kanggo 3 basa pungkasan, utawa ora GC kanggo 3 saka 5 basa pungkasan.
4. Supaya struktur secondary ing sepisanan, lan supaya complementation antarane loro primers, utamané nglengkapi ing 3 'mburi, digunakake sepisanan dimer bakal kawangun lan non-tartamtu pita amplified bakal kui.
5. Ing basa ing 3 'mburi primer, utamané pungkasan lan penultimate basa, kudu strictly dipasangake supaya PCR Gagal amarga unpaired basa terminal.
6. Primer duwe utawa bisa ditambahake karo situs cleavage sing cocog, lan urutan target sing digedhekake luwih becik duwe situs cleavage sing cocog, sing migunani banget kanggo analisis cleavage utawa kloning molekuler.
7. Kekhususan primer: primer kudu ora duwe homologi sing jelas karo urutan liyane ing basis data urutan asam nukleat.
8. Sinau nggunakake piranti lunak: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Desain online iki paling apik).
Konten ing ndhuwur bisa ngrampungake paling ora 99% masalah desain primer.
Ngontrol rincian desain primer
1. dawa primer
Dawane primer umum yaiku 18-30 basa.Umumé, faktor sing paling penting kanggo nemtokake suhu anil primer yaiku dawa primer.Suhu annealing primer umume dipilih (nilai Tm -5 ℃), lan sawetara langsung nggunakake nilai Tm.Rumus ing ngisor iki bisa digunakake kanggo ngitung suhu anil primer.
Nalika dawa primer kurang saka 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Nalika dawa primer luwih saka 20bp: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (%GC) -500 / dawa-5 ℃
Kajaba iku, akeh piranti lunak uga bisa digunakake kanggo ngetung suhu annealing, prinsip pitungan bakal beda-beda, mula kadhangkala nilai sing diwilang bisa duwe celah cilik.Kanggo ngoptimalake reaksi PCR, primer paling cendhak sing njamin suhu anil ora kurang saka 54 ℃ digunakake kanggo efisiensi lan spesifik sing paling apik.
Sakabèhé, kekhususan primer mundhak kanthi faktor papat kanggo saben nukleotida tambahan, saéngga dawa primer minimal kanggo umume aplikasi yaiku 18 nukleotida.Watesan ndhuwur dawa primer ora penting banget, utamane ana hubungane karo efisiensi reaksi.Amarga entropi, saya suwe primer, luwih murah tingkat anneals kanggo ikatan karo target DNA kanggo mbentuk cithakan double-stranded stabil kanggo DNA polimerase kanggo ikatan.
Nalika nggunakake piranti lunak kanggo ngrancang primer, dawa primer bisa ditemtokake kanthi nilai TM, utamane kanggo primer PCR kuantitatif fluoresensi, TM = 60 ℃ utawa luwih kudu dikontrol.
2. Konten GC
Umumé, isi G + C ing urutan primer yaiku 40% ~ 60%, lan isi GC lan nilai Tm saka sepasang primer kudu dikoordinasi.Yen sepisanan nduweni kecenderungan GC utawa AT sing serius, jumlah buntut A, T utawa G lan C sing cocog bisa ditambahake menyang mburi primer 5 '.
3. Suhu Annealing
Suhu annealing kudu 5 ℃ luwih murah tinimbang suhu unchain.Yen jumlah dhasar sepisanan cilik, suhu annealing bisa ditambah kanthi tepat, sing bisa nambah kekhususan PCR.Yen jumlah basis gedhe, suhu annealing bisa dikurangi kanthi tepat.Bentenipun suhu annealing antarane sepasang primer saka 4 ℃ ~ 6 ℃ ora bakal mengaruhi ngasilaken PCR, nanging saenipun suhu annealing saka sepasang primer padha, kang bisa beda-beda antarane 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Ngindhari area struktur sekunder saka cithakan amplifikasi
Paling apik kanggo ngindhari wilayah struktur sekunder saka cithakan nalika milih fragmen sing digedhekake.Struktur sekunder stabil saka fragmen target bisa diprediksi lan ditaksir dening piranti lunak komputer sing cocog, sing migunani kanggo pilihan cithakan.Asil eksperimen nuduhake yen ekspansi asring ora kasil nalika energi bebas (△G) wilayah sing bakal ditambahi kurang saka 58.6lkJ/mol.
5. Ora cocog karo target DNA
Nalika urutan DNA target sing digedhekake gedhe, primer bisa ngiket ing pirang-pirang bagean saka target DNA, sing nyebabake sawetara pita katon ing asil kasebut.Wektu iki perlu nggunakake tes piranti lunak BLAST, situs web:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Pilih Align two sequences (bl2seq).
Nempelake urutan primer menyang zona 1 lan target urutan DNA menyang zona 2 bisa diganti, lan BLAST ngetung kemungkinan pelengkap, antisense, lan liya-liyane, mula pangguna ora perlu ngelingi manawa rantai loro kasebut minangka rantai rasa.Sampeyan uga bisa ngetik nomer GI yen ngerti nomer GI saka urutan ing database, supaya sampeyan ora kudu nempel bagean gedhe saka urutan.Pungkasan, klik Align ing 3 kanggo ndeleng manawa primer duwe pirang-pirang situs homolog ing DNA target.
6. Terminal Utama
Ing 3 'mburi sepisanan iku ngendi extension wiwit, supaya iku penting kanggo nyegah mismatches saka miwiti ana.Pungkasan 3 ora kudu luwih saka 3 G utawa C berturut-turut, amarga iki bakal nyebabake primer salah dipicu ing wilayah urutan pengayaan G + C.Ujung 3' ora bisa mbentuk struktur sekunder, kajaba ing reaksi PCR khusus (AS-PCR), ujung 3' primer ora bisa dicocogake.Contone, yen wilayah enkoding digedhèkaké, 3 'mburi sepisanan ngirim ora mungkasi ing posisi katelu saka kodon, amarga posisi katelu saka kodon punika rawan degenerate, kang bakal mengaruhi specificity lan efficiency amplifikasi.Nalika nggunakake primer aneksasi, waca tabel panggunaan kodon, perhatikan preferensi biologis, aja nggunakake primer aneksasi ing mburi 3′, lan gunakake konsentrasi primer sing luwih dhuwur (1uM-3uM).
7. Struktur sekunder primer
Primer dhewe ora kudu duwe urutan pelengkap, yen primer dhewe bakal melu ing struktur jepit rambut, lan struktur sekunder iki bakal mengaruhi ikatan primer lan template amarga alangan sterik.Yen pengadilan buatan digunakake, dhasar komplementer sing terus-terusan saka primer ora luwih saka 3bp.Ora ana komplementer ing antarane rong primer, utamane tumpang tindih komplementer saka ujung 3 kudu dihindari kanggo nyegah pembentukan dimer primer.Umumé, ora ana luwih saka 4 basis homologi utawa komplementaritas sing berturut-turut ing antarane pasangan primer.
8. Tambah tandha utawa loci
Pungkasan 5' nduweni pengaruh cilik ing spesifisitas amplifikasi lan mulane bisa diowahi tanpa mengaruhi spesifisitas amplifikasi.Modifikasi primer 5 'end kalebu: nambahake situs watesan enzim;Label biotin, fluoresensi, digoxin, Eu3+, lsp. Ngenalake urutan DNA pengikat protein;Ngenalke situs mutasi, nglebokake lan ilang urutan mutasi lan ngenalaken urutan promotor, etc.. Basa ekstra bakal luwih utawa kurang mengaruhi efficiency amplifikasi lan nambah kasempatan saka tatanan dimer primer, nanging sawetara konsesi kudu digawe kanggo langkah sabanjure.Urutan tambahan sing ora ana ing urutan target, kayata situs watesan lan urutan promotor, bisa ditambahake ing mburi 5 'primer tanpa mengaruhi spesifik.Urutan kasebut ora kalebu ing pitungan nilai Tm primer, nanging kudu diuji kanggo komplementaritas lan struktur sekunder internal.
9. Subklon
Umume wektu, PCR mung kloning awal, banjur kita kudu subclone fragmen target menyang macem-macem vektor, mula kita kudu ngrancang basis tambahan kanggo operasi sabanjure ing langkah PCR.
Sawetara urutan sing dirancang kanggo subkloning dirangkum ing ngisor iki.
Situs restriksi endonuklease ditambahake
Nambah situs watesan enzim minangka cara sing paling umum digunakake kanggo subkloning produk PCR.Umumé, situs cleavage enem basa, saliyane 5 'mburi situs cleavage kudu nambah 2 ~ 3 basa protèktif.Nanging, jumlah basa protèktif sing dibutuhake dening enzim sing beda beda.Contone, SalⅠ ora mbutuhake basa protèktif, EcoRⅤ mbutuhake 1 basa protèktif, OraⅠ mbutuhake 2 basa protèktif, lan Hind Ⅲ mbutuhake 3 basa protèktif.
LIC nambah buntut
Jeneng lengkap LIC yaiku kloning Ligation-Independent, cara kloning sing diciptakake dening Navogen khusus kanggo bagean vektor pET.Operator pET sing disiapake kanthi metode LIC nduweni ujung lengket tunggal 12-15 basa sing ora komplementer, sing nglengkapi ujung lengket sing cocog ing fragmen sisipan target.Kanggo tujuan amplifikasi, urutan primer 5′ saka fragmen sing dipasang kudu nglengkapi vektor LIC.Aktivitas extranect 3′→5′ saka T4 DNA polimerase bisa mbentuk untaian tunggal ujung lengket ing fragmen sing dilebokake sawise wektu sing cendhak.Amarga produk mung bisa kawangun saka annealing bebarengan saka pecahan insert disiapake lan vektor, cara iki cepet banget lan efisien, lan iku diarahake kloning.
Diarahake Klon TA nambah buntut
Kloning TA ora bisa nargetake fragmen kasebut dadi vektor, mula Invitrogen ngenalake vektor sing bisa target kloning, sing ngemot papat basis GTGGS sing penting ing salah sawijining ujung.Mulane, ing desain primer PCR, urutan pelengkap kudu ditambahake, supaya fragmen bisa "oriented".
Yen sampeyan kurang wektu, sampeyan bisa nyoba sintesis langsung, nggabungake gen karo vektor, sing diarani sintesis gen ET ing musecularists.
D. Metode kloning In-Fusion
Ora ana ligase sing dibutuhake, ora ana reaksi sing dawa.Anggere urutan ing loro ends saka vektor linearized ngenalaken Ing desain primers, banjur produk PCR lan vektor linearized ditambahake menyang solusi enzim in-fusion ngemot BSA lan diselehake ing suhu kamar kanggo setengah jam, transformasi bisa dileksanakake.Cara iki utamané cocok kanggo konversi volume gedhe.
10. Gabung primer
Kadhangkala, mung informasi urutan winates sing dingerteni babagan desain primer.Contone, yen mung urutan asam amino sing dingerteni, primer gabungan bisa dirancang.Primer penggabungan minangka campuran saka urutan sing beda-beda sing nuduhake kabeh kemungkinan basa sing beda-beda sing nyandi asam amino siji.Kanggo nambah kekhususan, sampeyan bisa ngrujuk ing tabel panggunaan kodon kanggo nyuda aneksasi miturut preferensi panggunaan dhasar saka macem-macem organisme.Hypoxanthine bisa dipasangake karo kabeh basa kanggo nyuda suhu anil primer.Aja nggunakake basa annexed ing 3' mburi primer amarga annealing saka 3 basa pungkasan ing 3' mburi cukup kanggo miwiti PCR ing situs salah.Konsentrasi primer sing luwih dhuwur (1μM nganti 3μM) digunakake amarga primer ing pirang-pirang campuran aneksasi ora spesifik kanggo cithakan target.
bahan baku PCRkontrol
1. Jumlah primer
Konsentrasi saben primer yaiku 0.1 ~ 1umol utawa 10 ~ 100pmol.Luwih becik ngasilake asil sing dibutuhake kanthi jumlah primer sing paling murah.Konsentrasi dhuwur saka primer bakal nimbulaké mismatch lan amplifikasi non-tartamtu, lan nambah kasempatan kanggo mbentuk dimer antarane primers.
2. Konsentrasi primer
Konsentrasi primer mengaruhi spesifik.Konsentrasi primer optimal umume antara 0,1 lan 0,5μM.Konsentrasi primer sing luwih dhuwur nyebabake amplifikasi produk nonspesifik.
3. Suhu Annealing saka primer
Parameter penting liyane kanggo primer yaiku suhu leleh (Tm).Iki minangka suhu nalika 50% saka primer lan urutan komplementer diwakili minangka molekul DNA untai ganda.Tm dibutuhake kanggo nyetel suhu anil PCR.Saenipun, suhu annealing cukup sithik kanggo njamin anil efektif saka primer kanthi urutan target, nanging cukup dhuwur kanggo nyuda ikatan nonspesifik.Suhu annealing cukup saka 55 ℃ nganti 70 ℃.Suhu Annealing umume disetel 5 ℃ luwih murah tinimbang Tm primer.
Ana sawetara rumus kanggo nyetel Tm, sing beda-beda gumantung saka rumus sing digunakake lan urutan primer.Amarga umume rumus nyedhiyakake nilai Tm sing dikira-kira, kabeh suhu anil mung minangka titik wiwitan.Spesifisitas bisa ditingkatake kanthi nganalisa sawetara reaksi sing terus nambah suhu anil.Mulai ing ngisor kira-kira Tm-5 ℃, lan mboko sithik nambah suhu annealing ing nambah saka 2 ℃.Suhu anil sing luwih dhuwur bakal nyuda pembentukan dimer primer lan produk non-spesifik.Kanggo asil sing paling apik, loro primer kudu duwe nilai Tm kira-kira.Yen prabédan Tm saka pasangan primer luwih saka 5 ℃, primer bakal nuduhake wiwitan palsu sing signifikan kanthi nggunakake suhu anil sing luwih murah ing siklus kasebut.Yen rong primer Tm beda, atur suhu anil dadi 5 ℃ luwih murah tinimbang Tm paling murah.Utawa, kanggo nambah kekhususan, limang siklus bisa ditindakake dhisik ing suhu anil sing dirancang kanggo Tm sing luwih dhuwur, banjur siklus sing isih ana ing suhu anil sing dirancang kanggo Tm sing luwih murah.Iki ngidini salinan sebagean saka cithakan tujuan dipikolehi ing kahanan nyenyet.
4. Primer kemurnian lan stabilitas
Kemurnian standar primer khusus cukup kanggo umume aplikasi PCR.Ngilangi klompok benzoyl lan isobutylyl kanthi desalting minimal lan mulane ora ngganggu PCR.Sawetara aplikasi mbutuhake dimurnèkaké kanggo mbusak sembarang urutan non-full-dawa ing proses sintesis.Urutan sing dipotong iki kedadeyan amarga efisiensi kimia sintesis DNA ora 100%.Iki minangka proses bunder sing nggunakake reaksi kimia sing bola-bali amarga saben basa ditambahake kanggo nggawe DNA saka 3' nganti 5'.Sampeyan bisa gagal ing salah siji siklus.Primer sing luwih dawa, utamane sing luwih saka 50 basa, duwe proporsi gedhe saka urutan sing dipotong lan mbutuhake pemurnian.
Ngasilake primer dipengaruhi dening efisiensi kimia sintetik lan metode pemurnian.Perusahaan biofarmasi, kayata Cytology lan Shengong, kabeh nggunakake unit OD minimal kanggo njamin total output oligonucleoside.Primer khusus dikirim ing wangun bubuk garing.Paling apik kanggo mbubarake primer ing TE supaya konsentrasi pungkasan yaiku 100μM.TE luwih apik tinimbang banyu deionisasi amarga pH banyu asring ngandhut asam lan bakal nyebabake hidrolisis oligonukleosida.
Stabilitas primer gumantung ing kahanan panyimpenan.Wêdakakêna garing lan primer sing larut kudu disimpen ing -20 ℃.Primer sing larut ing TE ing konsentrasi luwih saka 10μM bisa disimpen kanthi stabil ing -20 ℃ sajrone 6 sasi, nanging mung bisa disimpen ing suhu kamar (15 ℃ nganti 30 ℃) kurang saka 1 minggu.Primer bubuk garing bisa disimpen ing -20 C paling sethithik 1 taun lan ing suhu kamar (15 C nganti 30 C) nganti 2 sasi.
5. Enzim lan konsentrasi
Saiki, polimerase DNA Taq sing digunakake yaiku enzim rekayasa gen sing disintesis dening bakteri coliform.Jumlah enzim sing dibutuhake kanggo katalisis reaksi PCR sing khas kira-kira 2,5U (nuduhake volume reaksi total 100ul).Yen konsentrasi dhuwur banget, bisa nyebabake amplifikasi non-spesifik;yen konsentrasi banget kurang, jumlah produk sintetik bakal suda.
6. Kualitas lan konsentrasi dNTP
Kualitas dNTP raket banget karo konsentrasi lan efisiensi amplifikasi PCR.Wêdakakêna dNTP iku granular, lan variabilitasé ilang aktivitas biologis yen ora disimpen kanthi bener.solusi dNTP ngandhut asam, lan kudu digunakake ing konsentrasi dhuwur, karo 1M NaOH utawa 1M Tris.HCL solusi buffer kanggo nyetel PH sawijining kanggo 7,0 ~ 7,5, jumlah cilik saka sub-packaging, panyimpenan beku ing -20 ℃.Multiple freeze-thawing bakal ngrusak dNTP.Ing reaksi PCR, dNTP kudu 50 ~ 200umol / L.Utamané, manungsa waé kudu mbayar kanggo konsentrasi saka papat DNTPS kudu witjaksono (preparasi mol witjaksono).Yen konsentrasi salah sijine beda karo liyane (luwih dhuwur utawa luwih murah), ora cocog bakal disebabake.Konsentrasi sing sithik banget bakal nyuda asil produk PCR.dNTP bisa gabung karo Mg2+ lan nyuda konsentrasi Mg2+ gratis.
7. Cithakan (gen target) asam nukleat
Jumlah lan tingkat pemurnian asam nukleat cithakan minangka salah sawijining kunci kanggo sukses utawa gagal PCR.Cara purifikasi DNA tradisional biasane nggunakake SDS lan protease K kanggo nyerna lan mbuwang spesimen.Fungsi utama SDS yaiku: mbubarake lipid lan protein ing membran sel, saéngga ngrusak membran sel kanthi mbubarake protein membran, lan dissociate protein nuklir ing sel, SDS uga bisa gabung karo protein lan endapan;Protease K bisa nghidrolisis lan nyerna protèin, utamané histon sing kaiket karo DNA, banjur nganggo fénol pelarut organik lan kloroform kanggo ngekstrak protèin lan komponèn sèl liyané, lan nganggo etanol utawa isopropil alkohol kanggo ngendapaké asam nukleat.Asam nukleat sing diekstrak bisa digunakake minangka cithakan kanggo reaksi PCR.Kanggo spesimen deteksi klinis umum, cara sing cepet lan prasaja bisa digunakake kanggo mbubarake sel, patogen lysate, nyerna lan mbusak protein saka kromosom kanggo mbebasake gen target, lan langsung digunakake kanggo amplifikasi PCR.Ekstraksi cithakan RNA biasane nggunakake metode guanidine isothiocyanate utawa protease K kanggo nyegah RNase ngrusak RNA.
8. Konsentrasi Mg2+
Mg2+ nduwe pengaruh signifikan marang spesifisitas lan ngasilake amplifikasi PCR.Ing reaksi PCR umum, nalika konsentrasi macem-macem dNTP yaiku 200umol / L, konsentrasi Mg2 + sing cocog yaiku 1.5 ~ 2.0mmol / L.Konsentrasi Mg2+ dhuwur banget, spesifisitas reaksi mudhun, amplifikasi non-spesifik, konsentrasi sing sithik banget bakal nyuda aktivitas polimerase DNA Taq, sing nyebabake nyuda produk reaksi.
Ion magnesium mengaruhi sawetara aspek PCR, kayata aktivitas polimerase DNA, sing mengaruhi asil;Conto liyane yaiku anil primer, sing mengaruhi kekhususan.dNTP lan cithakan ikatan karo ion magnesium, nyuda jumlah ion magnesium gratis sing dibutuhake kanggo aktivitas enzim.Konsentrasi ion magnesium optimal beda-beda kanggo pasangan primer lan template sing beda-beda, nanging konsentrasi wiwitan PCR sing khas karo 200μM dNTP yaiku 1,5mM (cathetan: Kanggo PCR kuantitatif wektu nyata, gunakake solusi ion magnesium 3 nganti 5mM kanthi probe fluoresensi).Konsentrasi ion magnesium gratis sing luwih dhuwur nambah asil, nanging uga nambah amplifikasi nonspesifik lan nyuda kasetyan.Kanggo nemtokake konsentrasi optimal, titrasi ion magnesium ditindakake kanthi tambahan 0,5mM saka 1mM nganti 3mM.Kanggo nyuda katergantungan ing optimasi ion magnesium, Platinum Taq DNA polymerase bisa digunakake.Platinum Taq DNA polymerase bisa njaga fungsi sajrone konsentrasi ion magnesium sing luwih akeh tinimbang polimerase DNA Taq lan mulane mbutuhake kurang optimalisasi.
9. Pcr-mromokake aditif
Optimization saka suhu anil, desain primer, lan konsentrasi ion Magnesium cukup kanggo amplifikasi Highly tartamtu saka paling cithakan;Nanging, sawetara cithakan, kalebu sing isi GC dhuwur, mbutuhake langkah tambahan.Aditif sing mengaruhi suhu leleh DNA nyedhiyakake cara liya kanggo ningkatake kekhususan lan asil produk.Denaturasi lengkap cithakan dibutuhake kanggo asil paling apik.
Kajaba iku, struktur sekunder nyegah ikatan primer lan ekstensi enzim.
Aditif PCR, kalebu formamide, DMSO, gliserin, betaine, lan PCRx Enhancer Solution, nambah amplifikasi.Mekanisme sing bisa ditindakake yaiku nyuda suhu leleh, saéngga mbantu anil primer lan mbantu ekstensi polimerase DNA liwat wilayah struktur sekunder.Solusi PCRx duwe kaluwihan liyane.Optimasi ion magnesium minimal dibutuhake nalika digunakake karo polimerase DNA Platinum Taq lan polimerase DNA Platinum Pfx.Mangkono, teknik Platinum digabungake karo aditif kanggo nambah spesifik nalika ngurangi katergantungan pendekatan katelu, optimasi ion magnesium.Kanggo asil sing paling apik, konsentrasi aditif kudu dioptimalake, utamane DMSO, formamida, lan gliserol, sing nyegah polimerase DNA Taq.
10. wiwitan panas
PCR wiwitan panas minangka salah sawijining cara sing paling penting kanggo nambah kekhususan PCR saliyane desain primer sing apik.Sanajan suhu elongasi optimal saka polimerase DNA Taq yaiku 72 ℃, polimerase tetep aktif ing suhu kamar.Mangkono, produk non-spesifik diprodhuksi nalika suhu ditahan luwih murah tinimbang suhu anil sajrone nyiapake reaksi PCR lan ing wiwitan siklus termal.Sawise kawangun, produk nonspesifik iki kanthi efektif digedhekake.Hot-start PCR utamané efektif nalika situs sing digunakake kanggo desain primer diwatesi dening lokasi unsur genetik, kayata mutasi sing diarahake situs, kloning ekspresi, utawa konstruksi lan manipulasi unsur genetik sing digunakake kanggo rekayasa DNA.
Cara umum kanggo mbatesi aktivitas Taq DNA polymerase yaiku nyiyapake solusi reaksi PCR ing es lan dilebokake ing piranti PCR sing wis digawe panas.Cara iki prasaja lan murah, nanging ora ngrampungake aktivitas enzim lan mulane ora ngilangi amplifikasi produk sing ora spesifik.
Thermal priming tundha sintesis DNA kanthi nyegah komponen penting nganti piranti PCR tekan suhu denaturasi.Umume cara wiwitan termal manual, kalebu tambahan Taq DNA polymerase sing tundha, ora angel, utamane kanggo aplikasi kanthi tingkat dhuwur.Cara priming termal liyane nggunakake tameng lilin kanggo nyakup komponen penting, kalebu ion magnesium utawa enzim, utawa kanggo ngisolasi komponen reaktif kanthi fisik, kayata cithakan lan buffer.Sajrone siklus termal, macem-macem komponen dibebasake lan dicampur bebarengan nalika lilin nyawiji.Kaya cara wiwitan panas manual, cara tameng lilin rumit lan rawan kontaminasi lan ora cocok kanggo aplikasi throughput sing dhuwur.
Platinum DNA polimerase trep lan efisien kanggo PCR wiwitan panas otomatis.Platinum Taq DNA polimerase kasusun saka rekombinan Taq DNA polimerase digabungake karo antibodi monoklonal marang Taq DNA polimerase.Antibodi diformulasikan dening PCR kanggo nyandhet aktivitas enzim sajrone nahan suhu sing suwe.Taq DNA polimerase dibebasake menyang reaksi sajrone insulasi 94 ℃ saka langkah denaturasi, mulihake aktivitas polimerase lengkap.Beda karo polimerase DNA Taq sing diowahi kanthi kimia kanggo wiwitan termal, enzim Platinum ora mbutuhake insulasi sing dawa ing 94 ℃ (10 nganti 15 menit) kanggo ngaktifake polimerase.Kanthi polimerase DNA PlatinumTaq, 90% aktivitas polimerase DNA Taq dibalekake sawise 2 menit ing 94 ℃.
11. Susuh-PCR
Putaran amplifikasi berturut-turut nggunakake primer bersarang bisa nambah spesifik lan sensitivitas.Babak pisanan minangka amplifikasi standar 15 nganti 20 siklus.Fraksi cilik saka produk amplifikasi awal diencerake 100 nganti 1000 kali lan ditambahake ing babak kapindho amplifikasi kanggo 15 nganti 20 siklus.Utawa, produk sing digedhekake awal bisa ukurane kanthi pemurnian gel.Primer bersarang digunakake ing amplifikasi babak kapindho, sing bisa ngiket urutan target ing primer pisanan.Panggunaan PCR nested nyuda kemungkinan amplifikasi sawetara situs target amarga ana sawetara urutan target sing nglengkapi loro set primer.Jumlah siklus sing padha (30 nganti 40) kanthi primer sing padha nggedhekake situs sing ora spesifik.Nested PCR nambah sensitivitas urutan target winates (contone, mrnas langka) lan nambah spesifik PCRS angel (contone 5′ RACE).
12. PCR mudhun
PCR mudhun nambah kekhususan kanthi nggunakake kondisi anil sing ketat kanggo sawetara siklus PCR pisanan.Siklus kasebut diwiwiti kanthi suhu anil kira-kira 5 ℃ luwih dhuwur tinimbang Tm sing dikira-kira, banjur saben siklus dikurangi 1 ℃ nganti 2 ℃ nganti suhu anil ngisor Tm 5 ℃.Mung cithakan tujuan kanthi homologi paling dhuwur bakal digedhekake.Produk iki terus berkembang ing siklus sakteruse, crowding metu produk nonspecific amplified.PCR mudhun migunani kanggo metode sing ora dingerteni tingkat homologi antarane cithakan primer lan target, kayata sidik jari DNA AFLP.
Kit PCR sing gegandhengan
Pahlawan PCR 2×TMSistem campuran nduweni toleransi sing luwih dhuwur kanggo inhibitor PCR tinimbang sistem Campuran PCR biasa, lan bisa gampang ngatasi amplifikasi PCR saka macem-macem template kompleks.Sistem reaksi unik lan Taq Hero efisiensi dhuwur nggawe reaksi PCR duwe efisiensi amplifikasi, spesifisitas lan sensitivitas sing luwih dhuwur.
Efisiensi amplifikasi sing luwih dhuwur
Nduwe aktivitas polimerase DNA 5'→3' lan aktivitas exonuclease 5'→3', tanpa aktivitas exonuclease 3'→5'.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Buffer sing dioptimalake khusus lan enzim Taq wiwitan panas bisa nyegah amplifikasi non-spesifik lan pembentukan dimer primer
Sensitivitas dhuwur-bisa ndeteksi salinan cithakan sing sithik
RT-PCR Easyᵀᴹ I (Salah Langkah)
Kit kasebut nggunakake reagen transkripsi terbalik Foregene sing unik lan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase digabungake karo sistem reaksi unik kanggo ningkatake efisiensi amplifikasi lan spesifik reaksi kanthi efektif.
Wektu kirim: Mei-09-2023
