1. Kawruh dhasar (yen sampeyan pengin ndeleng bagean eksperimen, mangga langsung transfer menyang bagean kapindho)
Minangka reaksi turunan saka PCR conventional, PCR wektu nyata utamané ngawasi owah-owahan saka jumlah produk amplifikasi ing saben siklus reaksi amplifikasi PCR ing wektu nyata liwat owah-owahan saka sinyal fluoresensi, lan quantitatively nganalisa cithakan wiwitan liwat hubungan antarane nilai ct lan kurva standar.
Data spesifik RT-PCR yaikudhasar, ambang fluoresensilanNilai Ct.
| dhasar: | Nilai fluoresensi saka siklus 3-15 minangka garis dasar (baseline), sing disebabake kesalahan pangukuran sok-sok. |
| Ambang (threshold): | Nuduhake watesan deteksi fluoresensi sing disetel ing posisi sing cocog ing wilayah pertumbuhan eksponensial saka kurva amplifikasi, umume 10 kaping standar deviasi garis dasar. |
| Nilai CT: | Iki minangka jumlah siklus PCR nalika nilai fluoresensi ing saben tabung reaksi tekan ambang. Nilai Ct berbanding terbalik karo jumlah cithakan awal. |
Cara label umum kanggo RT-PCR:
| cara | kauntungan | kekirangan | orane katrangan saka aplikasi |
| SYBR GreenⅠ | Aplikasi sing wiyar, sensitif, murah lan trep | Persyaratan primer dhuwur, rawan kanggo pita non-spesifik | Cocog kanggo analisis kuantitatif saka macem-macem gen target, riset babagan ekspresi gen, lan riset babagan kewan lan tanduran rekombinan transgenik. |
| TaqMan | Spesifisitas apik lan repeatability dhuwur | Rega dhuwur lan mung cocog kanggo tujuan tartamtu. | Deteksi patogen, riset gen resistensi obat, penilaian khasiat obat, diagnosis penyakit genetik. |
| suar molekuler | Spesifisitas dhuwur, fluoresensi, latar mburi kurang | Regane dhuwur, mung cocok kanggo tujuan tartamtu, desaine angel, lan regane dhuwur. | Analisis gen spesifik, analisis SNP |
2. Langkah eksperimen
2.1 Babagan pengelompokan eksperimen- kudu ana pirang-pirang sumur ing grup kasebut, lan kudu ana pengulangan biologis.
| ① | Kontrol kosong | Digunakake kanggo ndeteksi status pertumbuhan sel ing eksperimen |
| ② | SiRNA kontrol negatif (urutan siRNA non-spesifik) | Nduduhake spesifisitas aksi RNAi.siRNA bisa nyebabake respon stres non-spesifik ing konsentrasi 200nM. |
| ③ | Kontrol Reagen Transfeksi | Ngilangi keracunan reagen transfeksi menyang sel utawa efek ing ekspresi gen target |
| ④ | siRNA nglawan gen target | Ngalahake ekspresi gen target |
| ⑤ (opsional) | siRNA positif | Digunakake kanggo ngatasi masalah sistem eksperimen lan masalah operasional |
| ⑥ (opsional) | kontrol fluoresensi siRNA | Efisiensi transfeksi sel bisa diamati kanthi mikroskop |
2.2 Prinsip desain primer
| Ukuran fragmen sing digedhekake | Luwih becik ing 100-150bp |
| Panjang Primer | 18-25bp |
| kandungan GC | 30%-70%, luwih becik 45%-55% |
| Nilai tm | 58-60 ℃ |
| urut-urutan | Supaya T / C terus-terusan;A/G terus menerus |
| 3 urutan pungkasan | Aja sugih GC utawa sugih AT;pangkalan terminal luwih becik G utawa C;luwih becik ngindhari T |
| Komplementaritas | Ngindhari urutan pelengkap luwih saka 3 basa ing primer utawa ing antarane rong primer |
| Kekhususan | Gunakake telusuran blast kanggo konfirmasi kekhususan primer |
①SiRNA spesifik spesies, lan urutan spesies beda bakal beda.
②SiRNA dikemas ing bubuk beku-pepe, sing bisa disimpen kanthi stabil sajrone 2-4 minggu ing suhu kamar.
2.3 Piranti utawa reagen sing kudu disiapake luwih dhisik
| Primer (referensi internal) | Kalebu maju lan mundur loro |
| Primer (gen target) | Kalebu maju lan mundur loro |
| Target Si RNA (3 strip) | Umumé, perusahaan bakal sintesis 3 ngudani, lan banjur milih salah siji saka telu dening RT-PCR |
| Kit Transfeksi Kab | Lipo2000 etc. |
| Kit Ekstraksi Cepat RNA | Kanggo ekstraksi RNA sawise transfeksi |
| Kit Transkripsi Malik Rapid | kanggo sintesis cDNA |
| Kit Amplifikasi PCR | 2×Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 Babagan masalah sing kudu digatekake ing langkah eksperimen tartamtu:
①proses transfeksi siRNA
1. Kanggo plating, sampeyan bisa milih 24-well plate, 12-well plate utawa 6-well plate (konsentrasi RNA rata-rata sing diusulake ing saben sumur saka piring 24-well kira-kira 100-300 ng / uL), lan kapadhetan transfeksi optimal sel nganti 60% -80% utawa luwih.
2. Langkah-langkah transfeksi lan syarat spesifik sing strictly sesuai karo instruksi.
3. Sawise transfeksi, conto bisa diklumpukake sajrone 24-72 jam kanggo deteksi mRNA (RT-PCR) utawa deteksi protein sajrone 48-96 jam (WB)
② Proses ekstraksi RNA
1. Nyegah kontaminasi dening enzim eksogen.Utamane kalebu nganggo topeng lan sarung tangan kanthi ketat;nggunakake tip pipette steril lan tabung EP;banyu sing digunakake ing eksperimen kudu RNase-Free.
2. Dianjurake kanggo nindakake kaping pindho minangka disaranake ing kit extraction cepet, kang tenan bakal nambah kemurnian lan ngasilaken.
3. Cairan sampah ora kena ndemek kolom RNA.
③ Kuantifikasi RNA
Sawise RNA diekstrak, bisa diukur langsung karo Nanodrop, lan maca minimal bisa nganti 10ng/ul.
④Proses transkripsi mbalikke
1. Amarga sensitivitas dhuwur saka RT-qPCR, paling 3 sumur podo kudu digawe kanggo saben sampel kanggo nyegah Ct sakteruse saka beda banget utawa SD dadi gedhe banget kanggo analisis statistik.
2. Aja beku lan thaw Master mix bola-bali.
3. Saben tabung / bolongan kudu diganti karo tip anyar!Aja terus-terusan nggunakake tip pipette sing padha kanggo nambah conto!
4. Film sing ditempelake ing piring 96-sumur sawise nambahake sampel kudu dialusake nganggo piring.Paling apik kanggo centrifuge sadurunge sijine ing mesin, supaya Cairan ing tembok tabung bisa mili mudhun lan mbusak umpluk online.
⑤Analisis kurva umum
| Ora ana periode wutah logaritma | Bisa uga konsentrasi cithakan sing dhuwur |
| Ora ana nilai CT | Langkah-langkah sing salah kanggo ndeteksi sinyal fluoresensi; degradasi primer utawa probe - integritas bisa dideteksi dening elektroforesis PAGE; jumlah cithakan sing ora cukup; degradasi cithakan - ngindhari introduksi impurities lan pembekuan bola lan thawing ing preparation sampel; |
| Ct>38 | Efisiensi amplifikasi sing kurang;produk PCR dawa banget;macem-macem komponen reaksi rusak |
| Kurva amplifikasi linear | Probe bisa uga rusak sebagian dening siklus beku-thaw bola-bali utawa cahya sing suwe |
| Bentenipun ing bolongan duplikat utamané gedhe | Solusi reaksi ora rampung leleh utawa solusi reaksi ora dicampur;adus termal saka instrument PCR wis kontaminasi dening zat fluoresensi |
2.5 Babagan analisis data
Analisis data qPCR bisa dipérang dadi kuantifikasi relatif lan kuantifikasi absolut.Contone, sel ing klompok perawatan dibandhingake karo sel ing klompok kontrol,
Kaping pirang-pirang mRNA saka gen X diganti, iki minangka kuantifikasi relatif;ing sawetara sel, mRNA saka gen X
Pira salinan ana, iki kuantitas mutlak.Biasane sing paling akeh digunakake ing laboratorium yaiku metode kuantitatif relatif.Biasane,metode 2-ΔΔctpaling akeh digunakake ing eksperimen, mula mung cara iki sing bakal diterangake kanthi rinci ing kene.
Metode 2-ΔΔct: Asil sing dipikolehi yaiku bedane ekspresi gen target ing klompok eksperimen relatif karo gen target ing klompok kontrol.Dibutuhake efisiensi amplifikasi saka gen target lan gen referensi internal cedhak 100%, lan panyimpangan relatif ora ngluwihi 5%.
Cara ngitung kaya ing ngisor iki:
Klompok kontrol Δct = nilai ct gen target ing klompok kontrol - nilai ct gen referensi internal ing klompok kontrol
Δct klompok eksperimen = nilai ct saka gen target ing klompok eksperimen - nilai ct saka gen referensi internal ing klompok eksperimen
ΔΔct = Δct klompok eksperimen-Δct klompok kontrol
Pungkasan, ngitung macem-macem prabédan ing tingkat ekspresi:
Ganti Fold=2-ΔΔct (cocog karo fungsi excel yaiku POWER)
produk sing gegandhengan:
Wektu kirim: Mei-20-2023
