Ⅰ. Tambah sensitivitas sistem reaksi:
1. Pisah RNA kualitas dhuwur:
Sintesis cDNA sing sukses asale saka RNA sing berkualitas tinggi.RNA kanthi kualitas dhuwur kudu njamin paling sethithik total luwih suwe lan ora ngemot inhibitor sing ora ngemot enzim rekaman, kayata EDTA utawa SDS.Kualitas RNA nemtokake nilai maksimum informasi urutan sing bisa ditranskripsi menyang cDNA.Metode pemurnian RNA umum minangka metode langkah nggunakake isosianat / acidophenol.Kanggo nyegah polusi RNase, RNA sing dipisahake saka sampel sing sugih ing RNase (kayata pankreas) mbutuhake panyimpenan formaldehida kanggo nyimpen RNA kualitas dhuwur, sing luwih apik kanggo panyimpenan jangka panjang.RNA sing diekstrak saka ati tikus ing dasare rusak sawise panyimpenan seminggu ing banyu, dene RNA sing diekstrak saka limpa tikus tetep stabil sawise telung taun disimpen ing banyu.Kajaba iku, transkrip sing luwih gedhe tinimbang 4kb luwih sensitif kanggo nglacak degradasi RNase tinimbang transkrip cilik.Kanggo nambah stabilitas sampel RNA panyimpenan, RNA bisa larut ing ion methalmamine, lan disimpen -70 °C.Thylide digunakake kanggo nyimpen RNA ngirim ora ngemot macem-macem obyek sing ngrusak RNA.RNA, sing asalé saka pankreas, bisa disimpen ing methalmamine paling ora setaun.Yen wis siyap nggunakake RNA, sampeyan bisa nggunakake cara ing ngisor iki kanggo precipitate RNA: nambah NaCl kanggo 0,2m lan 4 kaping volume etanol, suhu kamar kanggo 3-5 menit, lan 10.000 × g centrifugal kanggo 5 menit.
2. Gunakake reverse transcriptase tanpa aktivitas RNaseH (RNaseH-):
Inhibitor RNase asring ditambahake kanggo reaksi transkripsi mbalikke kanggo nambah dawa lan ngasilake sintesis cDNA.Inhibitor RNase ditambahake ing reaksi sintesis rantai pisanan kanthi anané buffer lan agen pereduksi kayata DTT amarga proses sintesis pra-cDNA denaturasi inhibitor, saéngga ngeculake RNases terikat sing ngrusak RNA.Inhibitor RNase protein mung nyegah degradasi RNA dening RNase A, B, C, lan ora nyegah RNase ing kulit, mula kudu ati-ati supaya ora ngenalake RNases saka driji sanajan nggunakake inhibitor kasebut.
Reverse transcriptase catalyzes konversi RNA menyang cDNA.M-MLV lan AMV duwe aktivitas RNaseH endogen saliyane aktivitas polimerase dhewe.Aktivitas RNaseH saingan karo aktivitas polimerase kanggo untaian heterozigot sing dibentuk ing antarane template RNA lan primer DNA utawa untaian ekstensi cDNA, lan ngrusak RNA: untaian RNA ing kompleks DNA.Cithakan RNA sing dirusak dening aktivitas RNaseH ora bisa digunakake maneh minangka substrat efektif kanggo sintesis cDNA, nyuda asil lan dawa sintesis cDNA.Mangkono ngilangi utawa nyuda aktivitas RNaseH saka reverse transcriptase bakal entuk manfaat gedhe.
SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase saka RNaseH- lan thermoScript reverse transcriptase, AMV saka RNaseH- ngasilake cDNA luwih lengkap tinimbang MMLV lan AMV.Sensitivitas RT-PCR dipengaruhi dening jumlah cDNA sing disintesis.ThermoScript luwih sensitif tinimbang AMV.Ukuran produk RT-PCR diwatesi dening kemampuan reverse transcriptase kanggo nyintesis cDNA, utamane nalika kloning Cdna sing luwih gedhe.Dibandhingake karo MMLV, SuperScripⅡ ningkatake asil produk RT-PCR sing dawa.Transkripase terbalik RNaseH- uga nambah stabilitas termal, saéngga reaksi bisa ditindakake ing suhu sing luwih dhuwur tinimbang normal 37-42 ℃.Ing kahanan sintesis sing disaranake, primer oligo(dT) lan 10μCi [alpha-p]dCTP digunakake.Total produksi chain pisanan diwilang nggunakake metode presipitasi TCA.cDNA lengkap dianalisis nggunakake penghapusan strip ukuran-diurutake lan ngitung ing gel agarose alkalin.
3. Tambah suhu pengawetan panas saka transkripsi mbalikke:
Suhu panyekel sing luwih dhuwur mbantu mbukak struktur sekunder RNA lan nambah asil reaksi.Kanggo umume cithakan RNA, nahan RNA lan primer ing suhu 65 ° C tanpa buffer utawa uyah lan banjur adhem kanthi cepet ing es ngilangi struktur sekunder lan ngidini primer bisa ikatan.Nanging, sawetara cithakan isih duwe struktur sekunder, sanajan sawise denaturasi termal.Amplifikasi cithakan sing angel iki bisa ditindakake nggunakake ThermoScript reverse transcriptase lan kanthi nempatake reaksi reverse transcriptase ing suhu sing luwih dhuwur kanggo nambah amplifikasi.Suhu panyekelan sing luwih dhuwur uga bisa nambah kekhususan, utamane nalika sintesis cDNA ditindakake nggunakake primer spesifik gen (GSPS) (pirsani Bab 3).Yen nggunakake GSP, priksa manawa nilai Tm saka primer padha karo suhu nyekeli samesthine.Aja nggunakake oligo(dT) lan primer acak ndhuwur 60 ℃.Primer acak kudu ditahan ing 25 ℃ kanggo 10 menit sadurunge nambah dadi 60 ℃.Saliyane nggunakake suhu transkripsi mbalikke sing luwih dhuwur, kekhususan bisa ditingkatake kanthi langsung nransfer campuran RNA/primer saka suhu denaturasi 65 ℃ menyang suhu tahan transkripsi mbalikke lan nambah campuran reaksi 2 × sing wis digawe panas (sintesis inisiasi termal cDNA).Pendekatan iki mbantu nyegah pasangan basa antarmolekul sing dumadi ing suhu sing luwih murah.Nggunakake instrumen PCR nyederhanakake akeh ngalih suhu sing dibutuhake kanggo RT-PCR.
Polimerase stabil panas Tth tumindak minangka polimerase DNA ing ngarsane Mg2+ lan RNA polimerase ing ngarsane Mn2+.Bisa nahan panas nganti 65 ℃.Nanging, anané Mn2+ sajrone PCR nyuda kasetyan, sing ndadekake polimerase Tth kurang cocok kanggo amplifikasi presisi dhuwur, kayata kloning cDNA.Kajaba iku, Tth kurang efisien ing transkripsi mbalikke, sing nyuda sensitivitas, lan amarga enzim siji bisa nindakake transkripsi mbalikke lan PCR, reaksi kontrol tanpa transkripsi mbalikke ora bisa digunakake kanggo mbedakake produk cDNA sing digedhekake saka DNA genom sing terkontaminasi.
4. Aditif sing ningkatake transkripsi terbalik:
Penambahan aditif, kalebu gliserin lan DMSO, ing reaksi sintesis rantai pisanan bisa nyuda stabilitas untaian ganda asam nukleat lan ngeculake struktur sekunder RNA.Nganti 20% gliserin utawa 10% DMSO bisa ditambah tanpa mengaruhi aktivitas SuperScriptⅡ utawa MMLV.AMV uga bisa ngidinke nganti 20% gliserol tanpa ngurangi aktivitas.Kanggo nggedhekake sensitivitas RT-PCR ing reaksi transkripsi terbalik SuperScriptⅡ, 10% gliserol bisa ditambahake lan diisolasi ing 45 ℃.Yen 1/10 produk reaksi retrotranskripsi ditambahake menyang PCR, konsentrasi gliserol ing reaksi amplifikasi yaiku 0,4%, sing ora cukup kanggo nyegah PCR.
5. Pengolahan RNaseH:
Sensitivitas bisa ditingkatake kanthi nambani reaksi sintesis cDNA karo RNaseH sadurunge PCR.Kanggo sawetara cithakan, dianggep yen RNA ing reaksi sintesis cDNA nyegah ikatan produk sing digedhekake, mula perawatan RNaseH bisa nambah sensitivitas.Umume, perawatan RNaseH dibutuhake kanggo amplifikasi cithakan target cDNA lengkap sing relatif dawa, kayata tuberous scherosisⅡ kanthi salinan sing sithik.Kanggo cithakan sing angel iki, RNaseH nambah sinyal sing digawe dening cDNA sing disintesis dening SuperScriptⅡ utawa AMV.Kanggo umume reaksi RT-PCR, perawatan RNaseH opsional amarga langkah denaturasi PCR terisolasi 95 ℃ biasane nghidrolisis RNA saka RNA: kompleks DNA.
6. Cara sing luwih apik kanggo ndeteksi jumlah cilik RNA:
RT-PCR utamané tantangan nalika mung jumlah cilik saka RNA kasedhiya.Penambahan glikogen minangka pembawa sajrone pamisahan RNA mbantu nambah asil saka sampel cilik.Glikogen bebas RNase bisa ditambahake bebarengan karo Trizol.Glikogen larut ing banyu lan bisa tetep ing fase banyu kanthi RNA kanggo mbantu udan sabanjure.Konsentrasi glikogen bebas RNase sing disaranake yaiku 250μg / ml kanggo sampel kurang saka 50mg jaringan utawa 106 sel kultur.
Penambahan BSA acetylated kanggo mbalikke reaksi transkripsi nggunakake SuperScriptⅡ bisa nambah sensitivitas, lan kanggo jumlah cilik saka RNA, ngurangi jumlah SuperScriptⅡ lan nambah 40 unit RnaseOut nuclease inhibitor bisa nambah tingkat deteksi.Yen glikogen digunakake ing pemisahan RNA, tambahan inhibitor BSA utawa RNase kanggo mbalikke reaksi transkripsi nggunakake SuperScriptⅡ isih dianjurake.
Ⅱ. Tambah spesifik RT-PCR
1. sintesis cNDA:
Telung cara sing beda bisa digunakake kanggo miwiti sintesis cDNA untaian pertama, lan kekhususan relatif saben metode mengaruhi jumlah lan jinis cDNA sing disintesis.
Metode primer acak minangka cara paling ora spesifik saka telung metode kasebut.Primer dianil ing pirang-pirang situs ing saindhenging transkrip kanggo ngasilake cDNA sing cendhak, dawa sebagean.Cara iki asring digunakake kanggo njupuk urutan terminal 5′ lan cDNA saka cithakan RNA karo wilayah struktural sekunder utawa karo situs terminating sing mbalikke transcriptase ora bisa niru.Kanggo entuk cDNA paling dawa, rasio primer kanggo RNA ing saben sampel RNA kudu ditemtokake sacara empiris.Konsentrasi awal primer acak kisaran saka 50 nganti 250ng saben sistem reaksi 20μl.Amarga cDNA sing disintesis saka total RNA nggunakake primer acak utamane RNA ribosom, poli (A) + RNA umume dipilih minangka cithakan.
Inisiasi Oligo(dT) luwih spesifik tinimbang primer acak.Iki hibrida karo buntut poli(A) sing ditemokake ing mburi 3′ mRNA ing sel eukariotik.Amarga poli(A)+RNA kira-kira 1% nganti 2% saka total RNA, jumlah lan kerumitan cDNA luwih sithik tinimbang yen primer acak digunakake.Amarga kekhususan sing dhuwur, oligo(dT) umume ora mbutuhake optimasi kanggo rasio RNA kanggo primer lan pilihan poli(A)+.Disaranake nggunakake 0,5μg oligo(dT) saben sistem reaksi 20μl.oligo(dT)12-18 cocok kanggo paling RT-PCR.Sistem ThermoScript RT-PCR nyedhiyakake oligo(dT)20 amarga stabilitas termal sing apik lan cocok kanggo suhu sing luwih dhuwur.
Primer spesifik gen (GSP) minangka primer spesifik paling apik kanggo langkah transkripsi terbalik.GSP minangka oligonukleosida antisense sing bisa hibridisasi khusus karo urutan tujuan RNA, tinimbang nglebokake kabeh Rna kaya primer acak utawa oligo(dT).Aturan sing digunakake kanggo ngrancang primer PCR uga ditrapake kanggo desain reaksi transkripsi balik GSP.GSP bisa dadi urutan sing padha karo primer amplifikasi anil ing mburi mRNA3′, utawa GSP bisa dirancang kanggo anil ing hilir karo primer amplifikasi mbalikke.Kanggo sawetara obyek sing digedhekake, perlu kanggo ngrancang luwih saka siji primer antisense kanggo sukses RT-PCR amarga struktur sekunder saka target RNA bisa nyegah primer saka naleni.Disaranake nggunakake 1pmol antisense GSP ing sistem reaksi sintesis rantai pisanan 20μl.
2. Tambah suhu pengawetan panas saka transkripsi mbalikke:
Kanggo njupuk kauntungan saka kekhususan GSP, reverse transcriptase kanthi stabilitas termal dhuwur kudu digunakake.Transcriptase terbalik sing stabil panas bisa diisolasi ing suhu sing luwih dhuwur kanggo nambah kaku reaksi.Contone, yen GSP dianil ing 55 ° C, spesifisitas GSP ora bisa digunakake kanthi lengkap yen transkripsi mbalikke ditindakake ing 37 ° C kanthi kaku sing sithik nggunakake AMV utawa M-MLV.Nanging, SuperScripⅡ lan ThermoScript bisa bereaksi ing 50 ℃ utawa luwih dhuwur, sing ngilangi produk nonspesifik sing diprodhuksi ing suhu sing luwih murah.Kanggo spesifisitas maksimal, campuran RNA/primer bisa ditransfer langsung saka suhu denaturasi 65 ℃ menyang suhu tahan transkripsi mbalikke kanthi tambahan campuran reaksi 2 x sing wis digawe panas (inisiasi termal sintesis cDNA).Iki mbantu nyegah pasangan basa antarane molekul ing suhu kurang.Nggunakake instrumen PCR nyederhanakake akeh transisi suhu sing dibutuhake kanggo RT-PCR.
3. Ngurangi kontaminasi DNA genom:
Salah siji kangelan potensial karo RT-PCR yaiku RNA ngrusak DNA genom.Panganggone cara pemisahan RNA sing luwih apik, kayata Reagen Trizol, nyuda kontaminasi DNA genom ing persiapan RNA.Kanggo ngindhari produk sing diasilake saka DNA genom, RNA bisa diolah nganggo DnasⅠ kelas amplifikasi kanggo mbusak DNA sing kontaminasi sadurunge transkripsi mbalikke.Sampel disimpen ing 65 ℃ ing 2.0mM EDTA suwene 10 menit kanggo mungkasi pencernaan DNaseⅠ.EDTA chelates ion magnesium kanggo nyegah hidrolisis RNA gumantung ion magnesium sing dumadi ing suhu dhuwur.
Kanggo misahake cDNA sing diamplifikasi saka produk amplifikasi DNA genom, primer sing anil kanthi kapisah karo ekson sing dipisahake bisa dirancang.Produk PCR sing asalé saka cDNA bakal luwih cendhek tinimbang sing asalé saka DNA genomik sing kontaminasi.Eksperimen sing dikontrol tanpa transkripsi mbalikke uga ditindakake ing saben cithakan RNA kanggo nemtokake manawa fragmen kasebut saka DNA genom utawa cDNA.Produk PCR sing dipikolehi tanpa anané transkripsi terbalik asalé saka génom.
Produk sing gegandhengan
RT-PCR GampangᵀᴹAku (Salah Langkah)
- Kit siji-langkah mbisakake transkripsi mbalikke lan PCR bisa ditindakake ing tabung sing padha.Sampeyan mung perlu nambah RNA cithakan, primer PCR spesifik lan ddH Bebas RNase2O.
-Analisis kuantitatif RNA nyata-wektu bisa ditindakake kanthi cepet lan akurat.
-Kit nggunakake reagen transkripsi terbalik Foregene unik lan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase digabungake karo sistem reaksi unik kanggo ningkatake efisiensi amplifikasi lan spesifik reaksi kanthi efektif.
-Sistem reaksi sing dioptimalake ndadekake reaksi duwe sensitivitas deteksi sing luwih dhuwur, stabilitas termal sing luwih kuat, lan toleransi sing luwih apik.
-Kemampuan efisien kanggo mbusak gDNA, sing bisa mbusak gDNA ing cithakan ing 2 menit.
-Sistem transkripsi mbalikke sing efisien, mung butuh 15 menit kanggo ngrampungake sintesis cDNA untaian pertama.
-Cithakan Komplek: Cithakan karo isi GC dhuwur lan struktur secondary Komplek uga bisa mbalikke karo efficiency dhuwur.
-Sistem transkripsi mbalikke sensitivitas dhuwur, template level pg uga bisa entuk cDNA sing berkualitas tinggi.
-Sistem transkripsi mbalikke nduweni stabilitas termal sing dhuwur, suhu reaksi optimal yaiku 42 ℃, lan isih nduweni kinerja transkripsi mbalikke sing apik ing 50 ℃.
wektu Post: Mar-07-2023
