一, Nambah sensitivitas sistem reaksi:

1. Isolasi RNA kualitas dhuwur:

Sintesis cDNA sing sukses asale saka RNA sing berkualitas tinggi.RNA kualitas dhuwur kudu paling dawa lengkap lan bebas saka inhibitor transcriptase mbalikke kayata EDTA utawa SDS.Kualitas RNA nemtokake jumlah maksimum informasi urutan sing bisa ditranskripsi menyang cDNA.Cara pemurnian RNA sing umum yaiku metode siji-langkah nggunakake guanidine isothiocyanate / fenol asam.Kanggo nyegah kontaminasi kanthi jumlah RNase, RNA sing diisolasi saka conto sing sugih RNase (kayata pankreas) kudu disimpen ing formaldehida kanggo ngreksa RNA sing berkualitas, utamane kanggo panyimpenan jangka panjang.RNA sing diekstrak saka ati tikus dhasare rusak sawise disimpen ing banyu sajrone seminggu, dene RNA sing diekstrak saka limpa tikus tetep stabil sawise disimpen ing banyu suwene 3 taun.Kajaba iku, transkrip sing luwih dawa tinimbang 4 kb luwih sensitif marang degradasi dening trace RNases tinimbang transkrip cilik.Kanggo nambah stabilitas conto RNA sing disimpen, RNA bisa larut ing formamide deionisasi lan disimpen ing -70 ° C.Formamide sing digunakake kanggo ngreksa RNA kudu bebas saka lebu sing ngrusak RNA.RNA saka pankreas bisa disimpen ing formamide paling ora setaun.Nalika nyiapake nggunakake RNA, sampeyan bisa nggunakake cara ing ngisor iki kanggo precipitate RNA: nambah NaCl kanggo 0.2M lan 4 kaping volume etanol, Panggonan ing suhu kamar kanggo 3-5 menit, lan centrifuge ing 10.000 × g kanggo 5 menit.

2. Gunakake RNaseH-inactive (RNaseH-) reverse transcriptase:

Inhibitor RNase asring ditambahake kanggo reaksi transkripsi mbalikke kanggo nambah dawa lan ngasilake sintesis cDNA.Inhibitor RNase kudu ditambahake sajrone reaksi sintesis untaian pertama kanthi anané buffer lan agen reduktor (kayata DTT), amarga proses sadurunge sintesis cDNA denaturasi inhibitor, saéngga ngeculake RNase terikat sing bisa ngrusak RNA.Inhibitor protein RNase mung nyegah degradasi RNA dening RNase A, B, C, lan ora nyegah RNase ing kulit, mula ati-ati supaya ora ngenalake RNase saka driji sanajan nggunakake inhibitor kasebut.

Reverse transcriptase catalyzes konversi RNA kanggo cDNA.M-MLV lan AMV duwe aktivitas RNaseH endogen saliyane aktivitas polimerase dhewe.Aktivitas RNaseH lan aktivitas polimerase saingan siji liyane kanggo untaian hibrida sing dibentuk ing antarane cithakan RNA lan untai ekstensi DNA primer utawa cDNA, lan ngrusak untai RNA ing kompleks RNA:DNA.Cithakan RNA sing dirusak dening aktivitas RNaseH ora bisa dadi substrat efektif kanggo sintesis cDNA, sing nyuda asil lan dawa sintesis cDNA.Mulane, bakal migunani kanggo ngilangi utawa nyuda aktivitas RNaseH saka reverse transcriptase.

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase lan thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV, bisa entuk cDNA luwih akeh lan luwih lengkap tinimbang MMLV lan AMV.Sensitivitas RT-PCR bakal kena pengaruh jumlah sintesis cDNA.ThermoScript luwih sensitif tinimbang AMV.Ukuran produk RT-PCR diwatesi dening kemampuan reverse transcriptase kanggo nyintesis cDNA, utamane nalika kloning cDNA sing luwih gedhe.Dibandhingake karo MMLV, SuperScripⅡ ningkatake asil produk RT-PCR sing dawa.Transkripase terbalik RNaseH uga nambah thermostabilitas, mula reaksi kasebut bisa ditindakake ing suhu sing luwih dhuwur tinimbang 37-42°C normal.Ing kahanan sintesis sing disaranake, gunakake primer oligo(dT) lan 10 μCi saka [α-P]dCTP.Hasil total strand pertama dihitung dengan metode TCA precipitation.cDNA lengkap dianalisis nggunakake pita ukuran-diurutake dipotong lan diitung ing gel agarose alkalin.

3. Tambah suhu inkubasi kanggo transkripsi mbalikke:

Suhu inkubasi sing luwih dhuwur mbantu mbukak struktur sekunder RNA, nambah asil reaksi.Kanggo paling cithakan RNA, inkubasi RNA lan primer ing 65 ° C tanpa buffer utawa uyah, ngiring dening cooling cepet ing es bakal ngilangi paling struktur sekunder lan ngidini primer kanggo ikatan.Nanging, sawetara cithakan isih duwe struktur sekunder, sanajan sawise denaturasi panas.Amplifikasi cithakan sing angel iki bisa ditindakake nggunakake ThermoScript Reverse Transcriptase lan nempatake reaksi transkripsi mbalikke ing suhu sing luwih dhuwur kanggo nambah amplifikasi.Suhu inkubasi sing luwih dhuwur uga bisa nambah kekhususan, utamane nalika primer spesifik gen (GSP) digunakake kanggo sintesis cDNA (pirsani Bab 3).Yen nggunakake GSP, priksa manawa Tm saka primer padha karo suhu inkubasi sing dikarepake.Aja nggunakake oligo(dT) lan primer acak ing ndhuwur 60°C.Primer acak mbutuhake inkubasi ing 25 ° C suwene 10 menit sadurunge nambah nganti 60 ° C.Saliyane nggunakake suhu transkripsi terbalik sing luwih dhuwur, kekhususan uga bisa ditingkatake kanthi langsung nransfer campuran RNA/primer saka suhu denaturasi 65 ° C menyang suhu inkubasi transkripsi mbalikke lan nambahake campuran reaksi 2 × sing wis digawe panas (sintesis wiwitan panas cDNA).Pendekatan iki mbantu nyegah pasangan basa antarmolekul sing dumadi ing suhu sing luwih murah.Ngalih suhu kaping pirang-pirang sing dibutuhake kanggo RT-PCR bisa disederhanakake kanthi nggunakake siklus termal.

Polimerase termostabil Tth tumindak minangka polimerase DNA ing ngarsane Mg2+ lan minangka polimerase RNA ing ngarsane Mn2+.Bisa tetep anget ing suhu maksimal 65 ° C.Nanging, anané Mn2+ sajrone PCR nyuda kasetyan, sing ndadekake polimerase Tth kurang cocok kanggo amplifikasi presisi dhuwur, kayata kloning cDNA.Kajaba iku, Tth nduweni efisiensi transkripsi terbalik sing kurang, sing nyuda sensitivitas, lan, amarga transkripsi terbalik lan PCR bisa ditindakake kanthi enzim siji, reaksi kontrol tanpa transkripsi mbalikke ora bisa digunakake kanggo mbandhingake produk amplifikasi cDNA kanthi DNA genomik sing kontaminasi.Produk amplifikasi dipisahake.

4. Aditif sing ningkatake transkripsi terbalik:

Aditif kalebu gliserol lan DMSO ditambahake ing reaksi sintesis untaian pertama, sing bisa nyuda stabilitas untaian ganda asam nukleat lan ngeculake struktur sekunder RNA.Nganti 20% gliserol utawa 10% DMSO bisa ditambah tanpa mengaruhi aktivitas SuperScript II utawa MMLV.AMV uga bisa ngidinke nganti 20% gliserol tanpa mundhut aktivitas.Kanggo nggedhekake sensitivitas RT-PCR ing reaksi transkripsi terbalik SuperScriptⅡ, 10% gliserol bisa ditambahake lan diinkubasi ing 45°C.Yen 1/10 saka produk reaksi transkripsi mbalikke ditambahake menyang PCR, banjur konsentrasi gliserol ing reaksi amplifikasi yaiku 0,4%, sing ora cukup kanggo nyegah PCR.

5. Perawatan RNaseH:

Perawatan reaksi sintesis cDNA karo RNaseH sadurunge PCR bisa nambah sensitivitas.Kanggo sawetara cithakan, dianggep yen RNA ing reaksi sintesis cDNA nyegah ikatan produk amplifikasi, mula perawatan RNaseH bisa nambah sensitivitas.Umumé, perawatan RNaseH perlu nalika nggedhekake cithakan target cDNA lengkap sing luwih dawa, kayata scherosis tuberous II sing kurang salinan.Kanggo cithakan angel iki, perawatan RNaseH nambah sinyal diprodhuksi dening SuperScript II utawa AMV-sintesis cDNA.Kanggo umume reaksi RT-PCR, perawatan RNaseH opsional, amarga langkah denaturasi PCR ing 95 ° C umume hidrolisis RNA ing RNA: Komplek DNA.

6. Peningkatan Metode Deteksi RNA Cilik:

RT-PCR utamané tantangan nalika mung jumlah cilik saka RNA kasedhiya.Glikogen sing ditambahake minangka pembawa sajrone isolasi RNA mbantu nambah asil saka conto cilik.Glikogen bebas RNase bisa ditambahake bebarengan karo nambah Trizol.Glikogen larut ing banyu lan bisa disimpen ing fase banyu karo RNA kanggo mbantu udan sakteruse.Kanggo sampel kurang saka 50 mg jaringan utawa 106 sel kultur, konsentrasi glikogen bebas RNase sing disaranake yaiku 250 μg/ml.

Nambahake BSA acetylated menyang reaksi transkripsi mbalikke nggunakake SuperScript II bisa nambah sensitivitas, lan kanggo jumlah cilik saka RNA, ngurangi jumlah SuperScript II lan nambah 40 unit RNaseOut nuclease inhibitor bisa nambah tingkat deteksi.Yen glikogen digunakake ing proses isolasi RNA, isih dianjurake kanggo nambah inhibitor BSA utawa RNase nalika nggunakake SuperScript II kanggo reaksi transkripsi mbalikke.

二, Tambah spesifik RT-PCR

1. Asintesis CND:

Sintesis cDNA untaian pertama bisa diwiwiti kanthi nggunakake telung cara sing beda-beda, spesifikitas relatif sing mengaruhi jumlah lan jinis cDNA sing disintesis.

Metode primer acak minangka paling ora spesifik saka telung metode kasebut.Primer anneal ing pirang-pirang situs ing saindhenging transkrip, ngasilake cDNA sing cendhak lan sebagean.Cara iki kerep digunakake kanggo njupuk urutan pungkasan 5′ lan kanggo njupuk cDNA saka cithakan RNA kanthi wilayah struktur sekunder utawa situs terminasi sing ora bisa ditiru dening reverse transcriptase.Kanggo entuk cDNA paling dawa, rasio primer kanggo RNA ing saben sampel RNA kudu ditemtokake sacara empiris.Konsentrasi wiwitan primer acak berkisar antara 50 nganti 250 ng saben reaksi 20 μl.Wiwit cDNA disintesis saka total RNA nggunakake primer acak utamane RNA ribosom, poli (A) + RNA umume dipilih minangka cithakan.

Primer oligo(dT) luwih spesifik tinimbang primer acak.Iku hibrida menyang buntut poli(A) sing ditemokake ing mburi 3′ saka mRNA eukariotik.Amarga poli(A)+ RNA kira-kira 1% nganti 2% saka total RNA, jumlah lan kerumitan cDNA luwih sithik tinimbang karo primer acak.Amarga kekhususan sing dhuwur, oligo(dT) umume ora mbutuhake optimalisasi rasio RNA kanggo primer lan pilihan poli(A)+.Disaranake nggunakake 0,5μg oligo(dT) saben sistem reaksi 20μl.oligo(dT)12-18 cocok kanggo paling RT-PCR.Sistem ThermoScript RT-PCR nawakake oligo(dT)20 amarga stabilitas termal sing luwih apik kanggo suhu inkubasi sing luwih dhuwur.

Primer spesifik gen (GSP) minangka primer paling spesifik kanggo langkah transkripsi terbalik.GSP minangka oligonukleotida antisense sing bisa hibridisasi khusus menyang urutan target RNA, ora kaya primer acak utawa oligo(dT), sing nggabung karo kabeh RNA.Aturan sing padha digunakake kanggo ngrancang primer PCR ditrapake kanggo desain GSP ing reaksi transkripsi mbalikke.GSP bisa dadi urutan sing padha karo primer amplifikasi sing ana ing ujung 3′-paling mRNA, utawa GSP bisa dirancang kanggo anneal hilir primer amplifikasi mbalikke.Kanggo sawetara subyek sing digedhekake, luwih saka siji primer antisense kudu dirancang kanggo sukses RT-PCR amarga struktur sekunder saka target RNA bisa nyegah ikatan primer.Disaranake nggunakake 1 pmol antisense GSP ing reaksi sintesis untaian pertama 20 μl.

2. Tambah suhu inkubasi kanggo transkripsi mbalikke:

Kanggo entuk manfaat lengkap saka kekhususan GSP, transkripase terbalik kanthi thermostabilitas sing luwih dhuwur kudu digunakake.Transkripase reverse termotable bisa diinkubasi ing suhu sing luwih dhuwur kanggo nambah kenceng reaksi.Contone, yen GSP anil ing 55 ° C, kekhususan GSP ora bakal digunakake kanthi lengkap yen AMV utawa M-MLV digunakake kanggo transkripsi mbalikke ing stringency kurang saka 37 ° C.Nanging, SuperScript II lan ThermoScript bisa bereaksi ing 50 ° C utawa luwih dhuwur, sing bakal ngilangi produk non-spesifik sing diasilake ing suhu sing luwih murah.Kanggo spesifisitas maksimal, campuran RNA/primer bisa ditransfer langsung saka suhu denaturasi 65 ° C menyang suhu inkubasi transkripsi mbalikke lan ditambahake menyang campuran reaksi 2 × sing wis digawe panas (sintesis cDNA wiwitan panas).Iki mbantu nyegah pasangan basa antarmolekul ing suhu sing sithik.Transisi suhu kaping pirang-pirang sing dibutuhake kanggo RT-PCR bisa disederhanakake kanthi nggunakake siklus termal.

3. Nyuda kontaminasi DNA genom:

Kesulitan potensial sing ditemoni karo RT-PCR yaiku kontaminasi DNA genom ing RNA.Nggunakake metode isolasi RNA sing apik, kayata Trizol Reagent, bakal nyuda jumlah DNA genom sing ngobati persiapan RNA.Kanggo ngindhari produk sing asalé saka DNA genom, RNA bisa diobati nganggo DNase I kelas amplifikasi kanggo mbusak DNA sing kontaminasi sadurunge transkripsi mbalikke.Pencernaan DNase I diakhiri kanthi inkubasi sampel ing 2,0 mM EDTA suwene 10 menit ing suhu 65 ° C.EDTA bisa chelate ion magnesium, nyegah hidrolisis RNA gumantung ion magnesium ing suhu dhuwur.

Kanggo misahake cDNA sing dikuatake saka kontaminasi produk amplifikasi DNA genom, primer bisa dirancang supaya saben anil kanggo misahake ekson.Produk PCR sing asalé saka cDNA bakal luwih cendhek tinimbang sing asalé saka DNA genomik sing kontaminasi.Kajaba iku, eksperimen kontrol tanpa transkripsi mbalikke ditindakake ing saben cithakan RNA kanggo nemtokake manawa fragmen sing diwenehi asale saka DNA genom utawa cDNA.Produk PCR sing dipikolehi tanpa transkripsi terbalik asale saka genom.