RT-qPCR dikembangake saka teknologi PCR biasa.Nambahake bahan kimia neon (pewarna neon utawa probe neon) menyang sistem reaksi PCR tradisional, lan ndeteksi proses annealing lan extension PCR ing wektu nyata miturut mekanisme luminescent sing beda.Owah-owahan sinyal fluoresensi ing medium digunakake kanggo ngitung jumlah owah-owahan produk ing saben siklus PCR.Saiki, cara sing paling umum yaiku metode pewarna fluoresensi lan metode probe.

Metode pewarna neon:
Sawetara pewarna neon, kayata SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, lan liya-liyane, ora ngetokake cahya dhewe, nanging ngetokake fluoresensi sawise ngiket menyang alur cilik dsDNA.Mulane, ing wiwitan reaksi PCR, mesin ora bisa ndeteksi sinyal neon.Nalika reaksi diterusake menyang annealing-extension (metode rong langkah) utawa tahap extension (metode telung langkah), untaian ganda dibukak ing wektu iki, lan polimerase DNA anyar Sajrone sintesis untaian, molekul fluoresensi digabungake ing alur cilik dsDNA lan ngetokake fluoresensi.Nalika jumlah siklus PCR mundhak, akeh pewarna gabung karo dsDNA, lan sinyal neon uga terus ditingkatake.Njupuk SYBR Green Ⅰ minangka conto.
Metode probe:
Probe Taqman minangka probe hidrolisis sing paling umum digunakake.Ana klompok neon ing 5 'mburi probe, biasane FAM.Probe dhewe minangka urutan pelengkap kanggo gen target.Ana klompok quenching fluoresensi ing mburi 3' saka fluorofor.Miturut prinsip transfer energi resonansi fluoresensi (transfer energi resonansi Förster, FRET), nalika klompok neon reporter (molekul neon donor) lan klompok neon quenching (molekul neon akseptor) Nalika spektrum eksitasi tumpang tindih lan jarak sing cedhak banget (7-10nm), eksitasi saka molekul fluoresensi sing ringkih, nalika molekul fluoresensi sing ringkih. entek.Mulane, ing wiwitan reaksi PCR, nalika probe gratis lan utuh ing sistem, klompok neon reporter ora bakal ngetokake fluoresensi.Nalika annealing, primer lan probe ikatan karo cithakan.Sajrone tahap extension, polimerase terus-terusan nyintesis rantai anyar.DNA polimerase nduweni aktivitas exonuclease 5′-3′.Nalika tekan probe, polimerase DNA bakal nghidrolisis probe saka cithakan, misahake klompok neon reporter saka klompok neon quencher, lan ngeculake sinyal neon.Amarga ana hubungan siji-kanggo-siji antarane probe lan cithakan, metode probe luwih unggul tinimbang metode pewarna ing babagan akurasi lan sensitivitas tes.

Fig 1 Prinsip qRT-PCR

Desain dhasar
Prinsip:

Primer kudu dirancang ing wilayah konservasi saka seri asam nukleat lan duwe spesifisitas.

Paling apik nggunakake urutan cDNA, lan urutan mRNA uga bisa ditampa.Yen ora, goleki desain wilayah cd saka urutan DNA.
Dawane produk kuantitatif fluoresensi yaiku 80-150bp, sing paling dawa yaiku 300bp, dawa sepisanan umume antarane 17-25 basa, lan prabédan antarane primer hulu lan hilir ora kudu gedhe banget.

Isi G+C antarane 40% lan 60%, lan 45-55% paling apik.
Nilai TM antara 58-62 derajat.
Nyoba supaya dimer primer lan dimer dhewe, (ora katon luwih saka 4 pasang basa komplementer berturut-turut) struktur jepit rambut, yen ora bisa diendhani, nggawe ΔG<4.5kJ/mol* Yen sampeyan ora bisa mesthekake yen gDNA wis dibusak sak transkripsi mbalikke Clean, iku paling apik kanggo ngrancang primers saka intron *3′ mburi ora bisa ngindhari struktur AT, GC2, lan sugih terus-terusan (A/GC) ) primer dan non
spesifik Homologi saka urutan heterogen sing digedhekake luwih becik kurang saka 70% utawa nduweni 8 homologi basa komplementer.
Database:
Panelusuran CottonFGD kanthi tembung kunci
Desain dhasar:
Desain dhasar IDT-qPCR

Gambar 2. Halaman alat desain primer online IDT

Gambar 3 tampilan kaca asil
Desain primer lncRNA:
lncRNA:langkah padha karo mRNA.
miRNA:Prinsip metode stem-loop: Amarga kabeh miRNA minangka urutan cendhak sekitar 23 nt, deteksi PCR langsung ora bisa ditindakake, mula alat urutan stem-loop digunakake.Urutan stem-loop minangka DNA untai tunggal kira-kira 50 nt, sing bisa mbentuk struktur jepit rambut dhewe.3 'Pungkasan bisa dirancang minangka urutan pelengkap kanggo fragmen parsial miRNA, banjur miRNA target bisa disambungake menyang urutan stem-loop sajrone transkripsi mbalikke, lan dawa total bisa tekan 70bp, sing selaras karo dawa produk sing dikuatake sing ditemtokake dening qPCR.Desain primer miRNA tailing.
Deteksi khusus amplifikasi:
Database jeblugan online: jeblugan CottonFGD kanthi persamaan urutan
Blast lokal: Waca nggunakake Blast + kanggo nindakake blast lokal, linux lan macos bisa langsung nggawe database lokal, sistem win10 uga bisa ditindakake sawise nginstal ubuntu bash.Gawe database blast lokal lan blast lokal;mbukak ubuntu bash ing win10.
Cathetan: Kapas dataran tinggi lan katun pulo laut minangka tanduran tetraploid, mula asil jeblugan asring dadi loro utawa luwih cocog.Ing jaman biyen, nggunakake cd NAU minangka basis data kanggo nindakake jeblugan kemungkinan nemokake rong gen homolog kanthi mung sawetara beda SNP.Biasane, loro gen homolog ora bisa dipisahake kanthi desain primer, mula dianggep padha.Yen ana indel ketok, sepisanan biasane dirancang ing indel, nanging iki bisa mimpin kanggo struktur secondary sepisanan Energi free dadi luwih, anjog kanggo nyuda ing efficiency amplifikasi, nanging iki ora bisa diendhani.

Deteksi struktur sekunder primer:
Langkah-langkah:mbukak oligo 7 → urutan cithakan input → nutup sub-jendhela → nyimpen → nemokake sepisanan ing cithakan, penet ctrl+D kanggo nyetel dawa sepisanan → analisa macem-macem struktur secondary, kayata awak poto-dimerization, heterodimer, hairpin, mismatch, etc. Loro gambar pungkasan ing Figure 4 asil test saka primers.Asil saka sepisanan ngarep apik, ora ana struktur dimer lan jepit rambut sing jelas, ora ana basis komplementer sing terus-terusan, lan nilai absolut energi bebas kurang saka 4,5, nalika sepisanan mburi nuduhake kontinu.Kajaba iku, katon dimer luwih serius ing mburi 3 ', lan dimer saka 4 basa consecutive katon.Sanajan energi bebas ora dhuwur, 3′ dimer Chl bisa mengaruhi spesifik amplifikasi lan efisiensi amplifikasi.Kajaba iku, perlu kanggo mriksa jepit rambut, heterodimer, lan ora cocog.

Gambar 3 oligo7 asil deteksi
Deteksi efisiensi amplifikasi:
Efisiensi amplifikasi reaksi PCR mengaruhi asil PCR.Uga ing qRT-PCR, efisiensi amplifikasi penting banget kanggo asil kuantitatif.Mbusak zat, mesin lan protokol liyane ing buffer reaksi.Kualitas primer uga duwe pengaruh gedhe ing efisiensi amplifikasi qRT-PCR.Kanggo njamin akurasi asil, kuantifikasi fluoresensi relatif lan kuantifikasi fluoresensi absolut kudu ndeteksi efisiensi amplifikasi primer.Diakoni manawa efisiensi amplifikasi qRT-PCR sing efektif yaiku antarane 85% lan 115%.Ana rong cara:
1. Metode kurva standar:
a.Campur cDNA
b.Pengenceran gradien
c.qPCR
d.Persamaan regresi linier kanggo ngitung efisiensi amplifikasi
2. LinRegPCR
LinRegPCR minangka program kanggo analisis Data RT-PCR wektu nyata, uga disebut data PCR kuantitatif (qPCR) adhedhasar SYBR Green utawa kimia sing padha.Program nggunakake data didandani non-baseline, nindakake koreksi garis dasar ing saben sampel Kapisah, nemtokake jendhela-linearity lan banjur nggunakake analisis kemunduran linear pas garis lurus liwat pesawat data PCR.Saka kemiringan garis iki, efisiensi PCR saben sampel individu diitung.Efisiensi PCR rata-rata saben amplicon lan nilai Ct saben sampel digunakake kanggo ngetung konsentrasi wiwitan saben sampel, sing ditulis ing unit fluoresensi sing sewenang-wenang.Input lan output data liwat spreadsheet Excel.Mung sampel
nyawiji dibutuhake, ora gradien
langkah dibutuhake:(Njupuk Bole CFX96 minangka conto, ora cukup Mesin kanthi ABI sing jelas)
eksperimen:iku eksperimen qPCR standar.
output data qPCR:LinRegPCR bisa ngenali rong wujud file output: RDML utawa kuantifikasi asil Amplifikasi.Nyatane, iku nilai deteksi nyata-wektu saka nomer siklus lan sinyal fluoresensi dening mesin, lan amplifikasi dijupuk dening nganalisa Nilai owah-owahan fluoresensi saka efficiency segmen linear.
Pilihan data: Ing teori, nilai RDML kudu bisa digunakake.Dikira-kira masalah komputerku yaiku piranti lunak ora bisa ngenali RDML, mula aku duwe nilai output excel minangka data asli.Dianjurake kanggo nindakake screening kasar saka data pisanan, kayata Gagal nambah conto, etc. Poin bisa dibusak ing data output (mesthi, sampeyan ora bisa mbusak mau, LinRegPCR bakal nglirwakake titik kasebut ing tataran mengko)

Fig5 ekspor data qPCR

Gambar 6 pemilihan sampel kandidat

Input data:Mbukak asil amplifikasi kualifikasi.xls, → mbukak LinRegPCR → file → maca saka excel → pilih paramèter kaya sing ditampilake ing Gambar 7 → OK → klik nemtokake garis dasar

Gambar 7 langkah input data linRegPCR

asil:Yen ora ana pengulangan, ora ana klompok sing dibutuhake.Yen ana pengulangan, panglompokan bisa diowahi ing klompok sampel, lan jeneng gen dilebokake ing pengenal, banjur gen sing padha bakal dikelompokake kanthi otomatis.Pungkasan, klik file kasebut, ekspor excel, lan deleng asil.Efisiensi amplifikasi lan asil R2 saben sumur bakal ditampilake.Kapindho, yen sampeyan dibagi dadi klompok, efisiensi amplifikasi rata-rata sing didandani bakal ditampilake.Priksa manawa efisiensi amplifikasi saben primer antara 85% lan 115%.Yen gedhe banget utawa cilik banget, tegese efisiensi amplifikasi primer kurang.

Fig 8 Asil lan output data

Proses eksperimental:
Syarat mutu RNA:
Kemurnian:1.72.0 nuduhake yen ana sisa isothiocyanate.Asam nukleat resik A260 / A230 kudu watara 2 .Yen ana panyerepan kuwat ing 230 nm, iku nuduhake yen ana senyawa organik kayata ion phenate.Kajaba iku, bisa dideteksi kanthi elektroforesis gel agarose 1,5%.Titikake panandha, amarga ssRNA ora duwe denaturasi lan logaritma bobot molekul ora duwe hubungan linear, lan bobot molekul ora bisa ditulis kanthi bener.Konsentrasi: Teoritisorakurang saka 100ng / ul, yen konsentrasi banget kurang, kemurnian umume kurang ora dhuwur

Gambar 9 RNA gel

Kajaba iku, yen sampel larang regane lan konsentrasi RNA dhuwur, dianjurake kanggo aliquot sawise extraction, lan dilute RNA kanggo konsentrasi final 100-300ng / ul kanggo transkripsi mbalikke.Ingproses transkripsi terbalik, nalika mRNA ditranskripsi, primer oligo (dt) sing bisa ikatan khusus karo buntut polyA digunakake kanggo transkripsi mbalikke, dene lncRNA lan circRNA nggunakake primer hexamer acak (Random 6 mer) kanggo transkripsi mbalikke total RNA Kanggo miRNA, primer neck-loop khusus miRNA digunakake kanggo transkripsi mbalikke.Akeh perusahaan saiki wis ngluncurake kit tailing khusus.Kanggo metode stem-loop, metode tailing luwih trep, dhuwur-throughput, lan reagen-saving, nanging Efek mbedakake miRNA saka kulawarga sing padha ora kudu apik kaya metode stem-loop.Saben kit transkripsi mbalikke nduweni syarat kanggo konsentrasi primer spesifik gen (stem-loops).Referensi internal sing digunakake kanggo miRNA yaiku U6.Ing proses inversi stem-loop, tabung U6 kudu dibalik kanthi kapisah, lan primer ngarep lan mburi U6 kudu ditambahake langsung.SirrRNA lan lncRNA bisa nggunakake HKG minangka referensi internal.Ingdeteksi cDNA,
yen ora ana masalah karo RNA, cDNA uga kudu apik.Nanging, yen kasampurnan eksperimen ditindakake, luwih becik nggunakake gen referensi internal (Gen referensi, RG) sing bisa mbedakake gDNA saka cd.Umumé, RG minangka gen housekeeping., HKG) kaya sing dituduhake ing Gambar 10;Nalika iku, aku lagi nggawe protein panyimpenan kedelai, lan nggunakake actin7 ngemot intron minangka referensi internal.Ukuran fragmen amplifikasi primer iki ing gDNA yaiku 452bp, lan yen cDNA digunakake minangka cithakan, yaiku 142bp.Banjur asil test ketemu sing Part saka cDNA bener kontaminasi dening gDNA, lan uga mbuktekaken sing ora ana masalah karo asil transkripsi mbalikke, lan bisa digunakake minangka cithakan kanggo PCR.Ora ana gunane kanggo mbukak elektroforesis gel agarose langsung karo cDNA, lan minangka pita sing nyebar, sing ora ngyakinake.

Gambar 10 deteksi cDNA

Penentuan kondisi qPCRumume ora ana masalah miturut protokol kit, utamane ing langkah nilai tm.Yen sawetara primer ora dirancang kanthi apik sajrone desain primer, nyebabake bedane gedhe antarane nilai tm lan 60 ° C teoritis, dianjurake supaya cDNA Sawise sampel dicampur, jalanake PCR gradien kanthi primer, lan nyoba supaya ora nyetel suhu tanpa pita minangka nilai TM.

Analisis data

Cara pangolahan PCR kuantitatif fluoresensi relatif konvensional ing dasare miturut 2-ΔΔCT.Cithakan pangolahan data.

Produk sing gegandhengan:

Real Time PCR Gampang^TM -Taqman

Real Time PCR Gampang^TM – SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix kanggo sintesis cDNA untai pertama)

RT Easy II (Master Premix kanggo sintesis cDNA untaian pertama kanggo qPCR)