Saben uwong ngomong babagan prinsip eksperimen qRT-PCR, desain sepisanan, interpretasi asil, lan liya-liyane, nanging aku kudu nuduhake operasi eksperimen qRT-PCR.Iku cilik, nanging babagan asil.
Sadurunge nindakake qRT-PCR, kita kudu duwe pangerten sing jelas babagan RNA lan cara operasi kita dhewe.Sawise kabeh, usaha kita ngarahake entuk asil, tinimbang mung latihan.Dadi sadurunge nindakake qRT-PCR, kita kudu nemtokake masalah ing ngisor iki (sawetara mung ditrapake kanggo SYBR).
1 Apa sampeyan yakin RNA sampeyan ora rusak?
NanoDrop 2000 mung bisa ndeteksi konsentrasi lan kemurnian RNA, nanging ora bisa ndeteksi integritas RNA.
Nilai RNA (RNA Intesity Number) bisa nggambarake integritas RNA, sing dideteksi dening sistem Bioanalyzer Agilent 2100.
Gambar. Diagram skematis nilai RIN kanggo sampel RNA sing beda (eukariota)
Nanging, laboratorium umume ora duwe Agilent 2100 Bioanalyzer.Ing kasus iki, kita bisa ndeteksi liwat gel formaldehida, nanging syarat kanggo jumlah total RNA dhuwur, supaya cara paling cepet nggunakake elektroforesis gel biasa.Sampeyan kudu ana ing lingkungan bebas nuklease, mula kudu mbilas tangki elektroforesis, botol sol, braket gel lan sisir nganggo banyu DEPC.Agarose uga bebas nuklease (anggere dibukak anyar), lan Buffer Loading kudu dibukak kanthi anyar, kanthi gel 1,2%.
Elinga yen gel kudu dibubarake kanthi lengkap, yen ora bakal nyebabake pita sing ora homogen, kaya sing ditampilake ing conto 9 ing gambar kasebut.Yen voltase dhuwur banget utawa mlaku suwe banget bakal ngasilake panas lan nyebabake degradasi RNA, mula voltase lan wektu kudu dikontrol kanthi wajar.Kajaba iku, gel mlaku uga luwih bisa nemtokake manawa ana residu DNA ing sampel, lan mirsani manawa ana akeh band sing ditahan ing sumur dispensing.
Gambar.Deteksi elektroforesis gel saka RNA
2 Apa sampeyan yakin babagan konsentrasi cDNA sampeyan?
Pengalaman saka sedulur gedhe ing laboratorium yaiku cDNA saka sistem 20 ul sing dipikolehi saben inversi langsung diencerake 20X, dene adhine pasca-doktoral diencerake 10X.Aku biasane gumantung ing kahanan.Amarga kualitas RNA sing disebutake saben wong beda-beda, tingkat pembalikan uga beda, lan teknologi pembalikan bisa uga ora stabil.
Dadi saben-saben aku njaluk cDNA mbalikke, aku bakal diencerke dhisik babagan 3 kaping, banjur nggunakake gen housekeeping kanggo nindakake RT-PCR, nomer siklus umume 25 siklus, kanggo ngenali konsentrasi tartamtu, lan banjur nemtokake faktor pengenceran final.
3 Apa sampeyan yakin primer sampeyan gampang digunakake?
Iku bisa ngliwati kurva leleh saka qRT-PCR, nanging iki isih biaya dhuwit.Kanggo laboratorium tanpa dhuwit akeh, nalika entuk akeh primer, bisa nggunakake RT-PCR biasa kanggo ndeleng apa iku band siji lan ngenali spesifik primer.Yen laboratorium ora kekurangan dhuwit, kekhususan kabeh primer bisa diidentifikasi sapisan liwat kurva leleh.
4 Apa sampeyan yakin yen kahanan eksperimen sampeyan cocok?
SYBR kudu direksa saka cahya kuwat, supaya nyoba mateni lampu nduwur sirah nalika nambah reagen SYBR, lan mung perlu nggunakake cahya surem kanggo ngrampungake.
Simpen SYBR ing 4°C.Nalika digunakake, alon-alon walik munggah lan mudhun kanggo nyampur uga supaya ora foaming, lan ora vortex sregep.
Sawetara adhine seneng nggambar tandha ing papan PCR amarga wedi nyampurake conto, sing salah.Amarga spidol sampeyan banget kamungkinan kanggo mengaruhi koleksi sinyal fluoresensi, Aku umume nyaranake juniors nggunakake notebook eksperimen kanggo bantuan ing memori, minangka kapacak ing ngisor iki.
Gambar.qRT-PCR sampel loading diagram
5 Apa sampeyan yakin manawa sampeyan nindakake kanthi bener?
Priksa manawa nganggo sarung tangan, nganggo sarung tangan, nganggo sarung tangan, lan ngomong sing penting kaping telu.
Kanggo ngurangi cahya saka SYBR kanggo cahya, Aku wong kaya kanggo nambah cithakan pisanan, minangka ditampilake ing tokoh ngisor.Miturut pengalaman, tambahan cithakan cilik bisa nyebabake kesalahan sampling.Mulane, kanggo nyilikake kesalahan sing disebabake dening nambah jumlah cilik saka cithakan, Aku biasane pindho sampel maneh, lan pindho jumlah nalika nambah sampel kanggo ngurangi jumlah H2O2 ditambahaké.
Gambar.Diagram skematik loading qRT-PCR
Banjur atur sistem qRT-PCR kaya ing ngisor iki.
Gambar.diagram persiapan sistem qRT-PCR
CATETAN: Proses konfigurasi kudu ditindakake ing es.
Sawise nambahake sampel, tempel film sealing transparan.Coba aja ndemek permukaan film sealing transparan nganggo tangan, mung operate saka papan ing sisih loro film kasebut.Amarga sidik driji uga bisa mengaruhi pangumpulan sinyal fluoresensi.Banjur nggunakake centrifuge kanggo cepet centrifuge kanggo 10 s ing kacepetan kurang kanggo nyegah sampel saka hanging ing tembok.
Produk sing gegandhengan:
Wektu kirim: Apr-28-2023
