COVID-19 minangka penyakit infèksi sing disebabake dening Sindrom Pernafasan Akut Parah Coronavirus Tipe 2. Nalika wong kena infeksi, gejala sing paling umum yaiku demam, batuk, lan sesak ambegan.

Sampel sing digunakake kanggo tes bisa diklumpukake kanthi swab nasofaring utawa swab oropharyngeal.

Apa PCR?

Cara standar deteksi koronavirus yaiku reaksi rantai polimerase, PCR.Iki minangka cara sing akeh digunakake ing biologi molekuler.Bisa cepet nyalin jutaan nganti milyaran fragmen DNA spesifik.

Coronavirus anyar ngemot genom RNA untai tunggal sing dawa banget.Kanggo ndeteksi virus kasebut kanthi PCR, molekul RNA kudu diowahi dadi urutan DNA komplementer kanthi reverse transcriptase, lan DNA sing mentas disintesis bisa digedhekake kanthi prosedur PCR standar, sing umum dikenal minangka RT-PCR.

Proses RT-PCR

Ekstraksi RNA

Kanggo nindakake metode iki, RNA virus kudu diekstrak.Macem-macem kit pemurnian RNA bisa digunakake kanggo pamisahan sing trep, cepet lan efektif.

Kanggo ngekstrak RNA virus nggunakake kit komersial, tambahake sampel menyang tabung microcentrifuge banjur campur karo buffer lisis.Buffer iki banget denaturasi lan biasane kasusun saka fenol lan guanidine isothiocyanate.Kajaba iku, inhibitor RNase biasane ana ing buffer lisis kanggo njamin isolasi RNA virus sing utuh.

Sawise nambahake buffer lisis, vortex tabung campuran kanthi pulsa lan inkubasi ing suhu kamar.Virus kasebut banjur dilisisake ing kahanan denaturasi banget sing diwenehake dening buffer lisis.

Sawise sampel lysed, tabung centrifuge digunakake kanggo prosedur pemurnian.Sampel dilebokake ing tabung centrifuge lan banjur disentrifugasi.

Prosedur iki minangka metode ekstraksi fase padat sing fase stasioner kasusun saka matriks silika gel.

Ing kahanan uyah lan pH sing optimal, molekul RNA ngiket ing membran silika.

Ing wektu sing padha, protein lan rereged liyane dibusak.

Sawise centrifugation, sijine tabung centrifuge menyang tabung koleksi resik, discard filtrate, lan banjur nambah buffer ngumbah.

Selehake tabung ing centrifuge maneh kanggo meksa buffer wisuh liwat membran.Iki bakal mbusak kabeh impurities sing isih ana saka membran, mung ninggalake RNA sing kaiket ing gel silika.

Sawise sampel wis sakabeheng, sijine tabung menyang tabung microcentrifuge resik lan nambah buffer elusi.

Banjur disentrifugasi kanggo meksa buffer elusi liwat membran.Buffer elusi mbusak RNA virus saka kolom spin lan entuk RNA sing diresiki tanpa protein, inhibitor, lan kontaminasi liyane.

LANGKAH 2

Konsentrasi campuran

Sawise ngekstrak RNA virus, langkah sabanjure yaiku nyiyapake campuran reaksi kanggo amplifikasi PCR.Ing langkah iki, konsentrasi digunakake.Solusi pekat iki minangka larutan pekat pracampuran sing kasusun saka premix, reverse transcriptase, nukleotida, primer maju, primer reverse, probe TaqMan lan polimerase DNA.

Pungkasan, kanggo ngrampungake campuran reaksi iki, cithakan RNA ditambahake.Tabung dicampur kanthi vortexing pulsa, banjur campuran reaksi kasebut dimuat menyang piring PCR.Plat PCR biasane ngemot 96 sumur lan bisa nganalisa pirang-pirang conto bebarengan.

LANGKAH 3

amplifikasi PCR

Sabanjure, nyelehake piring ing mesin PCR, sing sejatine minangka cycler termal.

RT-PCR wektu nyata digunakake kanggo ndeteksi coronavirus novel 2019 kanthi nggedhekake urutan target ing gen RdrRP, gen E lan gen N.Pilihan gen target gumantung saka urutan primer lan probe.

Langkah pisanan saka RT-PCR yaiku transkripsi terbalik.Untaian pisanan saka DNA komplementer disintesis, sing diwiwiti dening primer reverse PCR, sing ngiket menyang bagean komplementer saka genom RNA virus.Banjur reverse transcriptase nambahake nukleotida DNA menyang ujung 3′ primer kanggo sintesis DNA pelengkap RNA virus.Suhu lan durasi langkah iki gumantung marang primer, RNA target, lan transkripase terbalik sing digunakake.

Sabanjure, langkah denaturasi awal ditrapake, sing nyebabake denaturasi hibrida RNA-DNA.Langkah iki perlu kanggo ngaktifake polimerase DNA.Ing wektu sing padha, reverse transcriptase ora aktif.

PCR kasusun saka seri siklus termal.Saben siklus kasusun saka denaturasi, annealing lan langkah ekstensi.

Langkah denaturasi nyakup pemanasan kamar reaksi nganti 95 derajat Celsius lan digunakake kanggo denaturasi cithakan DNA untai ganda.

Ing langkah sabanjure, suhu reaksi dikurangi dadi 58 derajat Celcius, saéngga primer maju bisa anil menyang bagian pelengkap saka cithakan DNA untai tunggal.Suhu annealing langsung gumantung saka dawa lan komposisi primer.

Ing langkah ekstensi, polimerase DNA nyintesis untaian DNA anyar sing dadi pelengkap untai cithakan DNA.Kanthi nambahake inti bebas sing komplementer ing cithakan ing arah 5′nganti 3′ saka campuran reaksi.Suhu langkah iki gumantung marang polimerase DNA sing digunakake.

Sawise siklus kapisan, target DNA untai ganda dipikolehi.

Banjur, mlebu ing siklus kapindho.DNA untai ganda didenaturasi kanggo ngasilake rong molekul DNA untai tunggal.

Ing langkah sabanjure, suhu reaksi diturunake, primer disambungake menyang saben cithakan DNA untai tunggal, lan probe Taq-man disambungake menyang bagean pelengkap DNA target.

Probe TaqMan kasusun saka fluorophore sing disambungake kanthi kovalen menyang ujung 5′ probe oligonukleotida.Nalika bungah dening sumber cahya saka cycler, fluorophore emits fluoresensi.Kajaba iku, probe dumadi saka quencher ing mburi 3′.Jarak saka gen reporter kanggo quencher nyegah deteksi fluoresensi.

Ing langkah ekstensi, polimerase DNA sintesis untaian anyar.Nalika polimerase tekan probe TaqMan, aktivitas 5′nuklease endogen mecah probe, misahake pewarna saka quencher.

Kanthi saben siklus PCR, luwih akeh molekul pewarna dibebasake, nyebabake paningkatan intensitas fluoresensi sing sebanding karo jumlah amplikon sing disintesis.

Cara iki ngidini kanggo ngira jumlah urutan tartamtu sing ana ing sampel.Jumlah fragmen DNA untai ganda tikel kaping pindho ing saben siklus.Mula, PCR bisa digunakake kanggo nganalisa conto sing cilik banget.

Kanggo ngukur sinyal neon, lampu halogen tungsten, panyaring eksitasi, reflektor, lensa, panyaring emisi lan kamera CCD sing digandhengake karo piranti.

STEP 4 Ndeteksi

Kanggo ngukur sinyal neon, lampu halogen tungsten, panyaring eksitasi, reflektor, lensa, panyaring emisi lan kamera CCD sing digandhengake karo piranti.

Cahya sing disaring saka lampu kasebut dibayangke dening reflektor, ngliwati lensa kondensor, lan fokus ing tengah saben bolongan.Banjur fluoresensi sing dipancarake saka bolongan kasebut dibayangke saka pangilon, ngliwati panyaring emisi, lan dideteksi dening kamera CCD.Ing saben siklus PCR, cahya fluorophore swasana ati bisa dideteksi dening CCD.

Ngonversi cahya sing dijupuk dadi data digital.Cara iki diarani nyata-wektu PCR, lan ngidini nyata-wektu ngawasi kemajuan reaksi PCR.