PCR (reaksi rantai polimerase) minangka salah sawijining teknologi amplifikasi DNA in-vitro, kanthi sejarah luwih saka 30 taun.

Teknologi PCR dipelopori dening Kary Mullis saka Cetus, AS ing taun 1983. Mullis nglamar paten PCR ing taun 1985 lan nerbitake makalah akademik PCR pisanan babagan Ilmu ing taun sing padha.Mullis dianugerahi Bebungah Nobel babagan kimia ing taun 1993 kanggo karyane.

Prinsip Dasar PCR

PCR bisa nggedhekake fragmen DNA target luwih saka siji yuta kaping.Prinsip kasebut ana ing katalisis DNA polimerase, nggunakake DNA untai induk minangka cithakan lan primer khusus minangka titik wiwitan kanggo ekstensi.Iki replikasi in vitro liwat langkah kayata denaturasi, annealing, lan extension.Proses DNA untai putri pelengkap DNA templat untai induk.

Proses PCR standar dipérang dadi telung langkah:

1. Denaturasi: Gunakake suhu dhuwur kanggo misahake untaian ganda DNA.Ikatan hidrogen antarane untaian ganda DNA rusak ing suhu dhuwur (93-98 ℃).

2.Annealing: Sawise DNA untai ganda dipisahake, mudhunake suhu supaya primer bisa ikatan karo DNA untai tunggal.

3. Ekstensi: DNA polimerase wiwit sintesis untaian komplementer ing sadawane untaian DNA saka primer sing kaiket nalika suhu diturunake.Nalika ekstensi rampung, siklus rampung, lan jumlah pecahan DNA tikel kaping pindho

Balesan telung langkah iki 25-35 kaping, jumlah fragmen DNA bakal nambah kanthi eksponensial.

Kepinteran PCR yaiku primer sing beda bisa dirancang kanggo gen target sing beda-beda, supaya fragmen gen target bisa digedhekake sajrone wektu sing cendhak.

Nganti saiki, PCR bisa dipérang dadi telung kategori, yaiku PCR biasa, PCR kuantitatif fluoresensi lan PCR digital.

Generasi pisanan saka PCR biasa

Gunakake instrumen amplifikasi PCR biasa kanggo nggedhekake gen target, banjur gunakake elektroforesis gel agarose kanggo ndeteksi produk, mung analisis kualitatif sing bisa ditindakake.

Kerugian utama PCR generasi pisanan:

1.Rawan kanggo amplifikasi non-tartamtu lan asil positif palsu.

2.Deteksi njupuk wektu dawa lan operasi iku cumbersome.

3. Mung tes kualitatif sing bisa ditindakake

PCR Real-Time generasi kapindho

PCR Real-Time, uga dikenal minangka qPCR, nggunakake probe neon sing bisa nuduhake kemajuan sistem reaksi, lan ngawasi akumulasi produk sing digedhekake liwat akumulasi sinyal fluoresensi, lan ngadili asil liwat kurva fluoresensi.Bisa diukur kanthi bantuan nilai Cq lan kurva standar.

Amarga teknologi qPCR ditindakake ing sistem tertutup, kemungkinan kontaminasi dikurangi, lan sinyal fluoresensi bisa dipantau kanggo deteksi kuantitatif, saengga paling akeh digunakake ing praktik klinis lan wis dadi teknologi dominan ing PCR.

Zat fluoresensi sing digunakake ing PCR kuantitatif neon nyata-nyata bisa dipérang dadi: TaqMan probe fluoresensi, beacon molekul lan pewarna neon.

1) TaqMan neon probe:

Sajrone amplifikasi PCR, probe fluoresensi khusus ditambahake nalika nambahake sepasang primer.Probe kasebut minangka oligonukleotida, lan ujung loro kasebut diwenehi label karo klompok neon reporter lan klompok neon quencher.

Nalika probe utuh, sinyal fluoresensi sing dipancarake dening klompok reporter diserap dening grup quenching;sajrone amplifikasi PCR, aktivitas exonuclease 5′-3′ enzim Taq cleaves lan degrades probe, nggawe klompok neon reporter lan quencher Klompok fluoresensi dipisahake, supaya sistem ngawasi fluoresensi bisa nampa sinyal fluoresensi, yaiku, saben-saben untaian DNA digedhèkaké, mbentuk sinyal fluoresensi sing lengkap, lan molekul fluoresensi wis digedhèkaké. produk PCR.

2) SYBR pewarna neon:

Ing sistem reaksi PCR, keluwihan pewarna neon SYBR ditambahake.Sawise pewarna fluoresensi SYBR ora digabungake sacara khusus menyang untaian ganda DNA, pewarna kasebut ngetokake sinyal fluoresensi.Molekul pewarna SYBR sing ora digabungake ing rantai ora bakal ngetokake sinyal neon, saéngga njamin sinyal neon Tambah produk PCR rampung disinkronake karo paningkatan produk PCR.SYBR mung ngiket DNA untai ganda, saengga kurva leleh bisa digunakake kanggo nemtokake manawa reaksi PCR spesifik.

3) Beacon molekuler:

Iki minangka probe oligonukleotida kanthi label ganda stem-loop sing mbentuk struktur jepit rambut watara 8 basa ing 5 lan 3 ujung.Urutan asam nukleat ing ujung loro kasebut dipasangake sacara komplementer, nyebabake gugus fluoresensi lan gugus quenching dadi nyenyet.Tutup, ora ana fluoresensi sing bakal diasilake.

Sawise produk PCR diasilake, sajrone proses annealing, bagian tengah mercusuar molekul dipasangake karo urutan DNA tartamtu, lan gen fluoresensi dipisahake saka gen quencher kanggo ngasilake fluoresensi.

Kerugian utama PCR generasi kapindho:

Sensitivitas isih kurang, lan deteksi spesimen sing kurang salinan ora akurat.

Ana pengaruh saka nilai latar mburi, lan asil rentan kanggo gangguan.

Nalika ana inhibitor PCR ing sistem reaksi, asil deteksi rentan kanggo gangguan.

PCR digital generasi katelu

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ngetung nomer salinan urutan target liwat deteksi titik pungkasan, lan bisa nindakake deteksi kuantitatif absolut akurat tanpa nggunakake kontrol internal lan kurva standar.

PCR digital nggunakake deteksi titik pungkasan lan ora gumantung marang nilai Ct (ambang siklus), saengga reaksi PCR digital kurang kena pengaruh efisiensi amplifikasi, lan toleransi kanggo inhibitor reaksi PCR saya apik, kanthi akurasi lan reproduksi sing dhuwur.

Amarga karakteristik sensitivitas dhuwur lan akurasi dhuwur, ora gampang diganggu dening inhibitor reaksi PCR, lan bisa entuk kuantifikasi absolut sing bener tanpa produk standar, sing wis dadi hotspot riset lan aplikasi.

Miturut macem-macem wujud unit reaksi, bisa dipérang dadi telung jinis utama: sistem microfluidic, chip lan droplet.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

Adhedhasar teknologi mikrofluida, cithakan DNA dipisahake.Teknologi microfluidic bisa nyadari sampel nano-nganyarke utawa generasi tetesan cilik, nanging tetesan mbutuhake cara adsorpsi khusus lan banjur digabungake karo sistem reaksi PCR.mdPCR wis mboko sithik diadopsi dening cara liyane ngganti.

2) PCR digital berbasis droplet, ddPCR:

Gunakake teknologi tetesan banyu-ing-lenga kanggo ngolah sampel dadi tetesan, lan dibagi sistem reaksi sing ngemot molekul asam nukleat dadi ewonan tetesan skala nano, sing saben-saben ora ngemot molekul target asam nukleat sing bakal dideteksi, utawa Ngandhut siji nganti sawetara molekul target asam nukleat sing bakal diuji.

3) PCR digital berbasis chip, cdPCR:

Gunakake teknologi jalur cairan terintegrasi kanggo ngukir akeh microtubes lan microcavities ing wafer silikon utawa kaca kuarsa, lan ngontrol aliran solusi liwat katup kontrol sing beda-beda, lan dibagi cairan sampel dadi nanometer kanthi ukuran sing padha menyang sumur reaksi kanggo Reaksi PCR digital kanggo entuk kuantifikasi mutlak.

Kerugian utama PCR generasi katelu:

Peralatan lan reagen larang.

Syarat kualitas cithakan dhuwur.Yen jumlah cithakan ngluwihi jumlah microsystem, iku bakal mokal kanggo ngitung, lan yen cilik banget, akurasi quantification bakal suda.

Positif palsu uga bisa diasilake nalika ana amplifikasi non-spesifik.