PCR, pirang-pirang PCR, PCR in situ, PCR mbalikke, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

Kita bakal ngurutake konsep, langkah lan rincian macem-macem PCR

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, diarani PCR, minangka teknologi biologi molekuler sing digunakake kanggo nggedhekake fragmen DNA tartamtu.Bisa dianggep minangka replikasi DNA khusus in vitro.DNA polimerase (DNA Polymerase I) ditemokake ing awal taun 1955, lan Fragmen Klenow saka E. Coli, sing nduweni nilai eksperimen lan kepraktisan, ditemokake dening Dr. H. Klenow ing awal taun 1970-an, nanging amarga enzim iki ora ngidinke suhu, suhu dhuwur bisa degenerasi, saengga ora ketemu reaksi rantai polimerase sing dhuwur.Enzim sing digunakake saiki (diarani Taq polymerase), diisolasi saka Thermus aquaticus, sawijining bakteri sumber panas ing taun 1976. Ciri-cirine yaiku bisa tahan suhu dhuwur lan minangka enzim sing becik, nanging digunakake kanthi wiyar sawisé taun 1980-an.Konsep asli saka prototipe primitif asli PCR padha karo ndandani lan nyalin gen, sing diusulake dening Dr. KJell Kleppe ing taun 1971. Dheweke nerbitake salinan gen sing prasaja lan cendhak pisanan (padha karo reaksi rong siklus pisanan PCR).PCR sing dikembangake saiki dikembangake dening Dr. Kary B. Mullis ing taun 1983. Dr. Mullis njabat perusahaan PE ing taun kasebut, mula PE nduweni status khusus ing industri PCR.Dr Mullis resmi nerbitake makalah pisanan sing ana hubungane karo Saiki lan liya-liyane ing taun 1985. Wiwit kuwi, panggunaan PCR nganti ewonan mil saben dina, lan kualitas makalah sing gegandhengan bisa diarani nggawe akeh metode riset liyane sing ora nyenengake.Sabanjure, teknologi PCR akeh digunakake ing riset ilmiah biologi lan aplikasi klinis, dadi teknologi paling penting ing riset biologi molekuler.Mullis uga menangaké Bebungah Nobel Kimia taun 1993.

PCRPrinsip

Prinsip dhasar teknologi PCR padha karo proses replikasi alami DNA, lan kekhususan kasebut gumantung marang primer oligonukleotida sing komplementer kanggo loro ujung urutan target.PCR kasusun saka degeneration-annealing-extending telung langkah reaksi dhasar: ①Degenerasi saka DNA cithakan: Sawise DNA cithakan digawe panas kanggo bab 93 ° C kanggo wektu tartamtu, solusi dual DNA kanggo DNA dual-chain kawangun dening amplifikasi PCR saka DNA Cithakan Ninggalake, nggawe chain siji supaya bisa digabungake karo sepisanan reaksi pisanan.②Anil (senyawa) saka DNA cithakan lan primer: Sawise DNA cithakan dipanaskan lan degenerasi dadi rantai tunggal, suhu mudhun nganti 55°C.Urutan komplementer saka primer lan template DNA rantai tunggal.③Perpanjangan primer: Cithakan DNA-ikatan primer adhedhasar tumindak TaqDNA polimerase, kanthi dNTP minangka bahan baku reaksi.Tansah prinsip réplikasi, sintesis chain salinan semi-undhang anyar sing nglengkapi chain DNA cithakan, lan siklus baleni degenerasi-annealing-ekstensi telung pangolahan bisa njaluk luwih "semi-reserved chain salinan", lan chain anyar iki kasedhiya maneh Dadi cithakan kanggo siklus sabanjuré.Butuh 2-4min kanggo ngrampungake daur ulang, gen target bisa digedhekake kaping pirang-pirang yuta sajrone 2-3 jam.

StandarPCRSistem Reaksi

Lima unsur reaksi PCR

Umume ana limang jinis zat sing melu reaksi PCR, yaiku primer, enzim, dNTP, template lan buffer (Mg2+ dibutuhake).[Prosedur PCR]

Proses PCR standar dipérang dadi telung langkah

1. Degenerasi DNA (90°C-96°C): Cithakan DNA rantai ganda ing aksi termal, ikatan hidrogen pecah, mbentuk DNA rantai tunggal.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Suhu sistem suda, sepisanan digabungake karo cithakan DNA kanggo mbentuk dual-chain lokal.

3. Extension (70 ℃ -75 ℃): Ing tumindak enzim Taq (kira-kira 72 ° C, kegiatan paling apik), dNTP digunakake minangka bahan mentahan, ngluwihi saka 5′ mburi primer → 3′ pungkasan, sintesis lan Cithakan nglengkapi saben chain DNA liyane.

Saben siklus wis denatured, anil lan ditambahi, dobel isi DNA.Saiki, amarga area amplifikasi cendhak, sawetara PCR bisa ditiru ing wektu sing cendhak sanajan aktivitas enzim Taq ora optimal, mula bisa diganti dadi rong langkah, yaiku, annealing lan extension bisa ditindakake ing 60 ° C-65 ° C ing wektu sing padha.Supaya nyuda proses ngangkat lan cooling lan nambah kacepetan respon.

Fitur Reaksi PCR

● Dhuwur-Spesifik

Faktor penentu spesifik respon PCR yaiku: ①Kombinasi spesifik primer lan DNA cithakan.②Prinsip pasangan basa.③Kasetyan reaksi sintesis polimerase TaqDNA.④Kekhususan lan konservatif gen target.

Kombinasi sing bener saka primer lan template minangka kunci.Ikatan primer lan cithakan lan ekstensi rantai primer adhedhasar prinsip cocog basa alkalin.Kasetyan reaksi sintesis polimerase lan resistensi suhu dhuwur saka polimerase DNA Taq kanggo nggawe ikatan (senyawa) cithakan lan primer ing reaksi kasebut bisa ditindakake ing suhu sing luwih dhuwur.Spesifisitas kombinasi tambah akeh.Klip kasebut bisa njaga tingkat akurasi sing dhuwur.Kanthi milih wilayah genetik target kanthi konservatif dhuwur lan konservatif dhuwur, kekhususan kasebut luwih dhuwur.

● Sensitivitas Dhuwur

Volume produksi produk PCR tambah dening indeks, kang bisa nggedhekake template wiwitan Picker (PG=10-12) kanggo nambah tingkat mikrokontroler kanggo tingkat micrograms (μg= -6).A sel target bisa dideteksi saka 1 yuta sel;ing deteksi virus, sensitivitas PCR bisa tekan 3 RFU (titik kosong sing dibentuk unit);tingkat deteksi minimal ing ilmu bakteri 3 bakteri.

● Prasaja lan Cepet

Refleksi PCR nggunakake polimerase DNA Taq suhu dhuwur, sing nambah solusi reaksi ing siji wektu, yaiku reaksi degenerasi-anneal-ekstensi ing solusi amplifikasi DNA lan pot adus banyu.Umumé, reaksi amplifikasi rampung ing 2 nganti 4 jam.Produk ditambah umume dianalisis kanthi pedhang listrik, lan ora kudu nggunakake isotop, ora ana polusi radioaktif, lan promosi gampang.

● Kemurnian spesimen kurang

Ora perlu misahake virus utawa bakteri lan sel kultur.Produk mentah DNA lan RNA bisa digunakake minangka amplifier.Deteksi amplifikasi DNA bisa digunakake langsung nggunakake spesimen klinis kayata getih, cairan awak, cairan cuci batuk, rambut, sel, lan jaringan urip.

PCRmasalah umum

● Negatif palsu, ora ana pita sing digedhekake

Tahap utama reaksi PCR kalebu: ① persiapan asam nukleat cithakan, ② kualitas lan spesifisitas primer, ③ kualitas enzim ④ kondisi siklus PCR.Nemokake alesan uga kudu dianalisis lan ditliti kanggo pranala ing ndhuwur.

Cithakan: ① Cithakan ngandhut macem-macem protein, ② Cithakan ngandhut inhibitor enzim Taq, ③ Protein ing cithakan ora diilangi, utamane protein klompok ing kromosom.⑤ Degenerasi asam nukleat deminer ora lengkap.Nalika kualitas enzim lan primer apik, ora ana pita amplifikasi, sing paling mungkin minangka perawatan pencernaan spesimen.Ana sing salah karo proses ekstraksi asam nukleat cithakan, supaya kanggo nyiapake solusi pencernaan sing efektif lan stabil, prosedur kasebut kudu didandani lan ora diganti kanthi sewenang-wenang.

Enzim inaktivasi: enzim anyar utawa enzim lawas lan anyar kudu digunakake bebarengan kanggo nganalisa apa aktivitas enzim ilang utawa ora cukup, nyebabake negatif palsu.Perlu dicathet yen enzim Taq utawa ethidium bromide kadhangkala dilalekake.

Primer: kualitas primer, konsentrasi primer, lan manawa konsentrasi loro primer simetris.Iki minangka alesan umum kanggo kegagalan PCR utawa pita sing saya tambah ora cocog lan rawan nyebar.Ana masalah karo kualitas primers sawetara nomer kumpulan.Loro primer duwe konsentrasi dhuwur lan konsentrasi kurang, nyebabake amplifikasi asimetris efisiensi rendah.Penanggulangan kasebut yaiku: ① Pilih primer sing apik kanggo sintesis unit.② Konsentrasi primer ora mung gumantung marang nilai OD, nanging uga menehi perhatian marang cairan asli primer kanggo nggawe elektroforesis gel gula agar.Mesthi ana zona strip primer, lan padhange loro primer kudu konsisten.Sabuk, PCR bisa gagal ing wektu iki, lan kudu ditanggulangi karo unit sintesis primer.Yen primer dhuwur, padhange kurang, lan konsentrasi kudu imbang nalika diencerke.③ Sepisanan kudu dibayar lan disimpen ing konsentrasi dhuwur kanggo nyegah sawetara pembekuan utawa long-term refrigeration bagéan saka kulkas, kang bakal nimbulaké sepisanan kanggo deteriorate lan degrade.④ Desain primer ora wajar, kayata dawa primer ora cukup, lan kluster di dibentuk ing antarane primer.

Konsentrasi Mg2+: Konsentrasi ion Mg2+ nduwe pengaruh gedhe marang efisiensi amplifikasi PCR.Konsentrasi sing berlebihan bisa nyuda jinis amplifikasi PCR.Yen konsentrasi banget kurang, output amplifikasi PCR malah bakal nggawe gagal amplifikasi PCR tanpa pita ekspansi.

Owah-owahan volume reaksi: Volume sing digunakake ing amplifikasi PCR yaiku 20ul, 30ul, lan 50ul utawa 100uL, volume gedhe saka aplikasi kanggo amplifikasi PCR disetel miturut macem-macem tujuan riset ilmiah lan uji klinis.Sawise nggawe volume cilik kayata 20ul, perlu kanggo nggawe kondisi kabel nalika nggawe ukuran, yen ora bakal gagal.

Alasan fisik: Transformasi penting banget kanggo amplifikasi PCR.Yen suhu degenerasi kurang, wektu degenerasi cendhak, bisa uga ana negatif palsu;suhu annealing banget kurang bisa nimbulaké amplifikasi non-spesifik lan nyuda efficiency amplifikasi tartamtu.Highly mengaruhi kombinasi primer lan cithakan kanggo nyuda efficiency amplifikasi PCR.Kadhangkala perlu nggunakake termometer standar kanggo ndeteksi variasi, annealing lan suhu sing luwih dhuwur ing extension utawa kompor larut banyu, sing minangka salah sawijining alasan kegagalan PCR.

Varian urutan target: Yen urutan target kedadeyan, mutasi utawa pambusakan, kombinasi prototipe lan cithakan digabungake, utawa amarga ora ana urutan target, primer lan cithakan bakal kelangan urutan pelengkap, lan amplifikasi PCR ora bakal sukses.

● Positif palsu

Pita amplifikasi PCR katon konsisten karo pita urutan target, lan kadhangkala pita kasebut luwih rapi lan luwih dhuwur.

Desain primer ora cocog: urutan amplifikasi sing dipilih lan urutan amplifikasi non-tujuan duwe homolog, dadi nalika amplifikasi PCR, produk PCR sing digedhèkaké minangka urutan non-tujuan.Urutan target cendhak banget utawa primer cendhak banget, lan cenderung positif palsu.Perlu didesain ulang.

Polusi silang saka urutan target utawa produk amplifikasi: Ana rong alasan kanggo polusi iki: Kaping pisanan, polusi silang kabeh genom utawa segmen gedhe, sing nyebabake positip palsu.Iki jenis positif palsu bisa ditanggulangi dening cara ing ngisor iki: Ati-ati lan alus sak operasi kanggo nyegah urutan target saka inhaled menyang gun sampel utawa cipratan metu saka tabung centrifugal.Kajaba enzim lan zat sing ora bisa tahan suhu dhuwur, kabeh reagen utawa peralatan kudu disinfeksi kanthi tekanan dhuwur.Pipa centrifugal lan conto kudu digunakake bebarengan.Yen perlu, sadurunge nambahake spesimen, tabung reaksi lan reagen kena sinar ultraviolet kanggo ngrusak asam nukleat sing ana.Kapindho, pecahan cilik ing polusi udara.Pecahan cilik iki luwih cendhek tinimbang urutan target, nanging nduweni homologi tartamtu.Bisa disambungake karo siji liyane.Sawise nglengkapi primer, produk PCR bisa ditambahi, sing bakal nyebabake produksi positif palsu.Bisa digunakake kanggo nyuda utawa ngilangi metode PCR nest.

● Muncul pita amplifikasi nonspesifik

Pita sing muncul sawise amplifikasi PCR ora konsisten karo ukuran sing dikarepake, utawa gedhe utawa cilik, utawa bebarengan, utawa ing wektu sing padha, pita amplifikasi spesifik lan pita amplifikasi non-spesifik.Munculé pita non-spesifik yaiku: Kaping pisanan, primer sing ora lengkap nglengkapi urutan target, utawa polimerisasi primer kanggo mbentuk kluster di.Kapindho yaiku konsentrasi ion MG2 + dhuwur banget, suhu anil banget, lan jumlah siklus PCR ana gandhengane.Kapindho, kualitas lan jumlah enzim.Asring, enzim saka sawetara sumber rentan marang pita non-khusus lan enzim saka sumber liyane ora kedadeyan.Kadhangkala amplifikasi enzim sing ora spesifik uga kedadeyan.Ing countermeasures punika: maneh dirancang attractives yen perlu.Ngurangi jumlah enzim utawa ngganti enzim saka sumber liyane.Ngurangi jumlah utami, nambah jumlah template kanthi tepat, lan nyuda jumlah siklus.Nambah suhu anil kanthi bener utawa gunakake metode rong titik suhu (degenerasi 93 ° C, anil lan ngluwihi udakara 65 ° C).

● Tampilake serbet utawa smear tape

Amplifikasi PCR kadhangkala katon ditrapake utawa dilapisi utawa sabuk kaya karpet.Amarga jumlah enzim sing akeh banget utawa kualitas enzim sing kurang apik, konsentrasi dNTP dhuwur banget, konsentrasi Mg2 + dhuwur banget, suhu annealing kurang, lan jumlah siklus akeh banget.Penanggulangan kasebut yaiku: ①Ngurangi jumlah enzim, utawa ngganti enzim saka sumber liya.②Ngurangi konsentrasi dNTP ③Ngurangi konsentrasi Mg2+ kanthi bener.④Tambah jumlah template lan nyuda jumlah siklus.

Produk sing gegandhengan

PCR Heroᵀᴹ (Kanthi Pewarna)

◮ Kasetyan sing luwih dhuwur: 6 kaping saka enzim Taq biasa;

◮ Kacepetan amplifikasi luwih cepet

◮ Luwih gampang adaptasi cithakan

◮ Efisiensi amplifikasi sing luwih dhuwur

◮ Toleransi lingkungan luwih kuwat: diselehake ing 37 ° C sajrone seminggu, njaga aktivitas luwih saka 90%;

◮ Nduwe aktivitas polimerase DNA 5'→3' lan aktivitas exonuclease 5'→3', tanpa aktivitas exonuclease 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (Kanthi Pewarna)

Sistem reaksi unik lan Taq DNA Polymerase kanthi efisiensi dhuwur ndadekake reaksi PCR nduweni efisiensi amplifikasi, spesifisitas lan sensitivitas sing luwih dhuwur.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Salah Langkah)-SYBR Green I

◮ Kit siji-langkah nggawe transkripsi terbalik lan qPCR rong reaksi ing tabung sing padha, mung perlu nambah RNA template, primer PCR spesifik lan ddH Bebas RNase₂O.

◮ Kit kasebut bisa nganalisa RNA virus utawa nglacak RNA kanthi cepet lan efisien.

◮ Kit nggunakake reagen transkripsi terbalik Foregene sing unik lan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase sing digabungake karo sistem reaksi unik kanggo ningkatake efisiensi amplifikasi lan spesifisitas reaksi kanthi efektif.

◮ Sistem reaksi sing dioptimalake ndadekake reaksi nduweni sensitivitas deteksi sing luwih dhuwur, stabilitas termal sing luwih kuat, lan toleransi sing luwih apik.

◮ RT-qPCR Gampang^TM(Salah Langkah) -SYBR Green aku kit nerangake karo ROX dye referensi internal, kang bisa digunakake kanggo ngilangke latar mburi sinyal lan sinyal kasalahan antarane sumur, kang trep kanggo pelanggan kanggo nggunakake ing macem-macem model instrumen PCR kuantitatif.

RT Gampang^TMII (Master Premix kanggo sintesis cDNA untaian pisanan kanggoPCR wektu nyata)

-Kemampuan efisien kanggo mbusak gDNA, sing bisa mbusak gDNA ing cithakan ing 2 menit.

-Sistem transkripsi mbalikke sing efisien, mung butuh 15 menit kanggo ngrampungake sintesis cDNA untaian pertama.

-Cithakan Komplek: Cithakan karo isi GC dhuwur lan struktur secondary Komplek uga bisa mbalikke karo efficiency dhuwur.

-Sistem transkripsi mbalikke sensitivitas dhuwur, template level pg uga bisa entuk cDNA sing berkualitas tinggi.

-Sistem transkripsi mbalikke nduweni stabilitas termal sing dhuwur, suhu reaksi optimal yaiku 42 ℃, lan isih nduweni kinerja transkripsi mbalikke sing apik ing 50 ℃.