RT-qPCR minangka eksperimen dhasar biologi molekuler, lan saben wong kudu ngerti.Utamane kalebu telung langkah: ekstraksi RNA, transkripsi mbalikke menyang cDNA, lan PCR kuantitatif fluoresensi nyata-wektu.Ora mbantu, apa sing kedadeyan?Iku kamungkinan sing ana masalah karoeksperimen transkripsi terbalik!Sanajan katon yen eksperimen transkripsi mbalikke mung perlu nambah RNA, dNTP, primer, lanreverse transcriptasemenyang tabung centrifuge lan nyampur uga, nanging ing proses operasi nyata, isih akeh rincian sing kudu mbayar manungsa waé kanggo.Ayo sinau babagan iki!

Kepiye cara ngadili kualitas RNA?
Kanggo entuk cDNA, kualitas RNA kritis!Kualitas RNA bisa dideteksi utamane saka rong aspek:
(1) Integritas RNA:Integritas RNA bisa diverifikasi kanthi elektroforesis gel agarose. Njupuk eukariota minangka conto, total RNA lengkap duwe telung pita sing cetha, bobot molekul saka gedhe nganti cilik yaiku 28S, 18S, lan 5S, lan 28S kaping pindho padhang tinimbang 18S;yen telung pita bisa katon, nanging jinis pita burem utawa Difusi tegese RNA sebagian rusak.Ing wektu iki, mangga langsung nindakake reaksi transkripsi mbalikke lan tambahake input cithakan kanthi tepat;yen mung pita kanthi bobot molekul cilik utawa ora ana pita sing bisa dideleng, RNA wis rusak lan kudu diekstraksi maneh.Agilent 2100 nuduhake integritas RNA kanthi diagram puncak lan nilai RIN.Yen asam nukleat utuh, garis dasar electropherogram rata;yen asam nukleat rusak banget, garis dasar ora rata lan luwih akeh puncak degradasi katon;Nilai RIN nggambarake integritas RNA, ing kisaran 0-10, luwih gedhe nilai kasebut, luwih apik kualitas RNA.Inggih, langkung inggil drajat kasampurnan.
(2) Kemurnian RNA:Rasio OD260/280 bisa dideteksi nganggo spektrofotometri UV.Yen rasio OD260/280 antarane 1,9 lan 2,1, kemurnian apik banget.
Sisa DNA genom bisa nyebabake asil kuantitatif sing ora akurat
Nalika RNA diekstrak, RNA sing ditampa bisa dicampur karo DNA genom (gDNA) sing durung diresiki.Mulane, cDNA sawise transkripsi mbalikke uga bakal dicampur karogDNA.Sajrone hilirqPCRreaksi,cDNAlan gDNA bisa digedhèkaké bebarengan, asil ing Nilai CT relatif cilik, supaya asil bisa bias.
Dadi apa sing kudu kita lakoni ing kahanan iki?Foregenenyaranake:
(1) Nindakake reresik genom ing RNA sing dibalik, sing bisa dicopot kanthi ekstraksi kolom sajrone ekstraksi RNA;
(2) Nambani RNA sing diekstrak nganggo DNaseI , nanging mungkasi karo EDTA;
reagen transkripsi terbalikkaro modul ngresiki genom;

Cara milih primer kanggo transkripsi mbalikke?
Primer transkripsi mbalikke uga mengaruhi asil saka reaksi transkripsi mbalikke.Sampeyan bisa milih primer acak, Oligo dT utawa primer spesifik gen kanggo transkripsi mbalikke miturut kahanan spesifik eksperimen:
(1) Transkrip spesifik: primer spesifik gen dianjurake;
(2) Transkrip fragmen dawa: Oligo dT/primer spesifik gen dianjurake;
(3) Pecahan internal transkrip segmen dawa: primer spesifik gen/ primer acak / primer acak + Oligo dT.Yen eksperimen qPCR sakteruse dileksanakake, Oligo dT ora bisa digunakake piyambak, amarga nggunakake Oligo dT piyambak bisa nimbulaké 3′ bias pungkasan, anjog kanggo asil eksperimen qPCR ora akurat;
(4) miRNA: Primer stem-loop utawa primer tailing bisa digunakake.

Kaping pirang-pirang cDNA produk transkripsi mbalikke kudu diencerake kanggo kuantifikasi?
Sawise entuk cDNA saka produk transkripsi mbalikke, kaping pirang-pirang cDNA kudu diencerake kanggo eksperimen qPCR penting banget.Yen konsentrasi cDNA dhuwur banget utawa sithik banget, efisiensi amplifikasi bisa uga kena pengaruh.Apa konsentrasi cDNA bisa diukur, lan kepiye carane?
(1) Konsentrasi cDNA saka produk transkripsi mbalikke ora bisa diukur, amarga saliyane produk cDNA, produk transkripsi mbalikke uga ngemot buffer residual transkripsi mbalikke, reverse transcriptase, primers, lan liya-liyane, sing bakal ngganggu asil pangukuran konsentrasi lan nyebabake OD260/280, OD260/280, OD260/230 ora nggambarake rasio abnormal.Ing wektu iki, sawetara kanca bakal ngomong, banjur aku bakal ngukur konsentrasi sawise dimurnèkaké;kene,Foregene kaya kanggo ngelingake yen cDNA ora dianjurake kanggo diresiki, amarga dawa cDNA dijupuk dening kuwalikan beda, lan cDNA cendhak bakal ilang ing dimurnèkaké.
(2) Dadi apa sing kudu ditindakake?Sadurunge eksperimen qPCR, gradien pengenceran cDNA bisa ditemtokake liwat pra-eksperimen.Contone: nggunakake solusi saham cDNA, pengenceran 10-fold, lan pengenceran 100-fold minangka template kanggo eksperimen qPCR, lan pilih faktor pengenceran kanthi nilai CT ing kisaran 18-28.

Kepiye carane miRNA kudu ditranskripsi malik?
miRNA minangka RNA molekul cilik untai tunggal kanthi ukuran udakara 22 nt sing ora ngode protein.Amarga dawane cendhak, metode qPCR konvensional angel kanggo ngitung langsung, mula asring perlu kanggo ngluwihi miRNA;cara transkripsi terbalik sing umum digunakake kanggo miRNA kalebu metode stem-loop lan metode tailing.
Cara stem-loop yaiku kanggo ndawakake miRNA kanthi nambahake primer stem-loop.Cara deteksi iki nduweni sensitivitas lan spesifik sing luwih dhuwur, nanging throughput deteksi kurang.Siji transkripsi mbalikke mung bisa ndeteksi siji miRNA lan referensi internal;cara nambah-buntut dumadi saka rong. Iki rampung dening tumindak gabungan saka rong enzim, yaiku PolyA polymerase lan reverse transcriptase.PolyA polymerase tanggung jawab kanggo nambahake buntut PolyA menyang miRNA kanggo nambah dawa, lan reverse transcriptase nindakake reaksi transkripsi mbalikke.Cara iki nduweni throughput deteksi dhuwur lan bisa ndeteksi macem-macem miRNA lan referensi internal ing siji transkripsi mbalikke, nanging sensitivitas lan spesifisitas kurang ing metode stem-loop.