PCR minangka teknologi amplifikasi asam nukleat sing paling akeh digunakake lan akeh digunakake amarga sensitivitas lan kekhususan.Nanging, PCR mbutuhake denaturasi termal bola-bali lan ora bisa nyingkirake watesan gumantung ing instrumen lan peralatan, sing mbatesi aplikasi ing tes lapangan klinis.

Wiwit awal 1990-an, akeh laboratorium wiwit ngembangake teknologi amplifikasi suhu konstan sing ora mbutuhake denaturasi termal.Saiki dheweke wis ngembangake teknologi amplifikasi isotermal loop-mediated, teknologi amplifikasi isotermal penggantian untai, teknologi amplifikasi isotermal lingkaran rolling, lan ketergantungan urutan asam nukleat.Teknologi amplifikasi isotermal lan teknologi liyane. 

Lamplifikasi isotermal oop-mediated

Prinsip amplifikasi adhedhasar kasunyatan manawa DNA ana ing kahanan keseimbangan dinamis sekitar 65 ° C.Nalika sembarang primer dipasangake basa lan ditambahake menyang bagean komplementer DNA untai ganda, untaian liyane bakal dissociate lan dadi untaian tunggal.

Ing suhu iki, DNA nggunakake 4 primer khusus kanggo ngandelake polimerase DNA pamindahan untai kanggo nggawe sintesis DNA pamindahan untai terus-terusan.

Kaping pisanan, nemtokake 6 wilayah spesifik F3, F2, F1, B1, B2, B3 ing gen target, banjur desain 4 primer adhedhasar 6 wilayah tartamtu kasebut (kaya sing dituduhake ing gambar ing ngisor iki):

Primer internal maju (FIP) dumadi saka F1c lan F2.

Primer batin mundur (BIP) dumadi saka B1c lan B2, lan TTTT digunakake minangka spacer ing tengah.

Primer njaba F3 lan B3 masing-masing kasusun saka wilayah F3 lan B3 ing gen target.

Ing sistem reaksi LAMP, konsentrasi primer njero kaping pirang-pirang tinimbang primer njaba.Primer njero pisanan digabungake karo untaian cithakan kanggo sintesis untaian komplementer kanggo mbentuk untaian ganda DNA.Sabanjure, primer njaba digabungake karo untaian template kanggo mbentuk untaian ganda DNA.Ing tumindak polimerase BstDNA, untaian komplementer sing disintesis dening primer njero dibebasake.Sawise sawetara reaksi, untaian komplementer pungkasane mbentuk untaian DNA tunggal kanthi struktur dumbbell.

Struktur dumbbell DNA untai tunggal dhewe digunakake minangka cithakan kanggo terus-terusan mbentuk DNA struktur stem-loop transisi kanthi ujung mbukak.Primer njero lan njaba nuntun DNA struktur stem-loop transisi kanggo terus-terusan ngalami pamindahan untai lan reaksi ekstensi, lan pungkasane mbentuk sawetara struktur stem-loop kanthi dawa sing beda.campuran DNA.

Kaluwihan lan cacat saka amplifikasi isothermal loop-mediated

Keuntungan saka LAMP:

(1) Efisiensi amplifikasi dhuwur, sing bisa nggedhekake 1-10 salinan gen target kanthi efektif sajrone 1 jam, lan efisiensi amplifikasi 10-100 kaping PCR biasa.

(2) Wektu reaksi cendhak, kekhususan kuwat, lan ora ana peralatan khusus sing dibutuhake.

Kekurangan LAMP:

(1) Syarat kanggo primer utamane dhuwur.

(2) Produk sing digedhekake ora bisa digunakake kanggo kloning lan urutan, nanging mung bisa digunakake kanggo pangadilan.

(3) Amarga sensitivitas sing kuat, gampang mbentuk aerosol, nyebabake positip palsu lan mengaruhi asil tes.

Samplifikasi trand displacement

Strand displacement amplification (SDA) minangka teknik amplifikasi DNA isotermal in vitro adhedhasar reaksi enzimatik sing pisanan diusulake dening sarjana Amerika Walker ing taun 1992.

Sistem dhasar SDA kalebu endonuklease restriksi, polimerase DNA kanthi aktivitas perpindahan untai, rong pasang primer, dNTP, lan ion kalsium lan magnesium lan sistem buffer.

Prinsip amplifikasi pamindahan untai adhedhasar urutan pangenalan endonuklease pembatasan sing dimodifikasi sacara kimia ing loro ujung DNA target.Endonuklease mbukak celah ing untaian DNA ing situs pangenalan, lan polimerase DNA ngluwihi celah 3′ End lan ngganti untaian DNA sabanjure.

Untaian tunggal DNA sing diganti bisa digabung karo primer lan ditambah dadi untaian ganda dening DNA polimerase.Proses iki diulang terus-terusan, supaya urutan target bisa digedhekake kanthi efisien.

Kaluwihan lan cacat teknologi amplifikasi pamindahan untai

Keuntungan saka SDA:

Efisiensi amplifikasi dhuwur, wektu reaksi cendhak, spesifisitas kuwat, lan ora ana peralatan khusus sing dibutuhake.

Kekurangan SDA:

Produk ora seragam, lan sawetara produk siji-terdampar lan pindho-terdampar tansah diprodhuksi ing siklus SDA, lan tailing mesthi bakal kelakon nalika dideteksi dening elektroforesis.

Ramplifikasi lingkaran olling

Rolling circle amplification (RCA) diusulake kanthi cara nggambar cara nyalin DNA saka organisme patogen kanthi nggulung bunder.Iki nuduhake panggunaan DNA bunder untaian tunggal minangka cithakan ing suhu konstan, lan polimerase DNA khusus (kayata Phi29) ) Ing tumindak sintesis DNA bunderan rolling kanggo entuk amplifikasi gen target.

RCA bisa dipérang dadi amplifikasi linear lan amplifikasi eksponensial.Efisiensi RCA linear bisa tekan 10⁵kaping, lan efisiensi RCA eksponensial bisa tekan 10⁹kaping.

Bedane prasaja, kaya sing dituduhake ing gambar ing ngisor iki, amplifikasi linier a mung nggunakake 1 primer, amplifikasi eksponensial b duwe 2 primer.

RCA linear uga disebut RCA primer tunggal.Primer ngiket DNA bunder lan ditambahi dening tumindak DNA polimerase.Prodhuk kasebut minangka untaian tunggal linier kanthi urutan repetitif akeh ewonan dawa saka siji daur ulang.

Wiwit produk RCA linear tansah disambungake menyang sepisanan wiwitan, fiksasi gampang sinyal minangka kauntungan utama.

RCA eksponensial, uga dikenal minangka Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), ing RCA eksponensial, siji primer nggedhekake produk RCA, primer kapindho hybridizes karo produk RCA lan ngluwihi, lan panggantos wis kaiket kanggo produk RCA Primer hilir ngluwihi untaian, lan mbaleni extension lan panggantos kanggo gawé RCA produk dendritik.

Kaluwihan lan cacat saka amplifikasi asam nukleat bunderan rolling

Keuntungan saka RCA:

Sensitivitas dhuwur, spesifik sing apik lan operasi sing gampang.

Kekurangan RCA:

Masalah latar mburi nalika deteksi sinyal.Sajrone reaksi RCA, probe padlock uncirculated lan DNA cithakan utawa RNA probe unbound bisa ngasilake sawetara sinyal latar mburi. 

Namplifikasi adhedhasar urutan ucleicacid

amplifikasi adhedhasar urutan asam nukleat (NASBA) minangka teknologi anyar sing dikembangake kanthi basis PCR.Iki minangka amplifikasi asam nukleat sing terus-terusan lan isotermal sing dipandu dening sepasang primer kanthi urutan promotor T7.Teknologi kasebut bisa nggedhekake cithakan RNA kira-kira 109 kaping sajrone 2 jam, yaiku 1000 kaping luwih dhuwur tinimbang cara PCR konvensional lan ora mbutuhake peralatan khusus.

Teknologi iki wis digunakake kanggo diagnosa penyakit kanthi cepet sanalika muncul, lan saiki akeh perusahaan nggunakake metode iki ing kit deteksi RNA.

Sanajan amplifikasi RNA uga bisa nggunakake teknologi PCR transkripsi mbalikke, NASBA nduweni kaluwihan dhewe: bisa ditindakake ing kondisi suhu sing relatif konstan, lan luwih stabil lan akurat tinimbang teknologi PCR tradisional.

Reaksi kasebut ana ing 41 derajat Celsius lan mbutuhake AMV (virus myeloblastosis unggas) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polimerase lan sepasang primer kanggo ngrampungake.

Proses utamane kalebu:

Primer maju ngemot urutan pelengkap saka promotor T7.Sajrone reaksi, primer maju ngiket untaian RNA lan dikatalisis dening enzim AMV kanggo mbentuk untai ganda DNA-RNA.

RNase H nyerna RNA ing untaian ganda hibrida lan nahan DNA untai tunggal.

Ing tumindak primer mbalikke lan enzim AMV, untaian ganda DNA sing ngemot urutan promotor T7 dibentuk.

Ing tumindak T7 RNA polymerase, proses transkripsi wis rampung lan akeh target RNA diprodhuksi.

Keuntungan saka NASBA:

(1) Sepisanan kasebut nduweni urutan promotor T7, nanging DNA untaian ganda manca ora duwe urutan promotor T7 lan ora bisa digedhekake, mula teknologi iki nduweni kekhususan lan sensitivitas sing dhuwur.

(2) NASBA langsung nggabungake proses transkripsi mbalikke menyang reaksi amplifikasi, nyepetake wektu reaksi.

Kekurangan NASBA:

(1) Komponen reaksi luwih rumit.

(2) Telung jinis enzim sing dibutuhake kanggo nggawe biaya reaksi luwih dhuwur.