PCR Wektu Nyata, uga dikenal minangka PCR kuantitatif utawa qPCR, minangka cara kanggo ngawasi lan analisis wektu nyata produk amplifikasi PCR.
Amarga PCR kuantitatif nduweni kaluwihan saka operasi prasaja, cepet lan trep, sensitivitas dhuwur, repeatability apik, lan tingkat ketularan kurang, iku digunakake digunakake ing medical testing, evaluasi khasiat tamba, riset expression gen, riset transgenik, deteksi gen, deteksi pathogen, kewan lan tanduran deteksi., testing pangan lan lapangan liyane.
Mulane, apa sampeyan melu riset dhasar ing ilmu urip, utawa karyawan perusahaan farmasi, perusahaan peternakan, perusahaan pangan, utawa malah karyawan inspeksi entri-metu lan biro karantina, departemen ngawasi lingkungan, rumah sakit lan unit liyane, sampeyan bakal luwih utawa kurang kapapar Utawa sampeyan kudu ngerti kawruh nguwasani PCR kuantitatif.

Prinsip Real Time PCR

PCR Wektu Nyata minangka cara ing ngendi zat fluoresensi ditambahake ing sistem reaksi PCR, lan intensitas sinyal fluoresensi ing proses reaksi PCR dipantau kanthi nyata kanthi instrumen PCR kuantitatif, lan pungkasane data eksperimen dianalisis lan diproses.

【Kurva amplifikasi】yaiku kurva sing nggambarake proses dinamis PCR.Kurva amplifikasi PCR dudu kurva eksponensial standar, nanging kurva sigmoid.

[Fase platform kurva amplifikasi]Kanthi nambah jumlah siklus PCR, inaktivasi DNA polimerase, panipisan dNTP lan primer, lan inhibisi reaksi sintesis dening reaksi pirofosfat produk sampingan, lan liya-liyane, PCR ora tansah nggedhekake eksponensial., lan pungkasane bakal mlebu dataran tinggi.

[Kurva Amplifikasi Wilayah Pertumbuhan Eksponensial]Senajan phase plateau beda-beda gumantung nemen, ing wilayah tartamtu saka wilayah wutah eksponensial saka kurva amplifikasi, repeatability apik banget, kang penting banget kanggo analisis kuantitatif PCR.

[Nilai ambang lan nilai Ct]Kita nyetel nilai watesan deteksi fluoresensi ing posisi sing cocog ing area pertumbuhan eksponensial saka kurva amplifikasi, yaiku nilai ambang (Ambang).Persimpangan nilai ambang lan kurva amplifikasi yaiku nilai Ct, yaiku nilai Ct nuduhake jumlah siklus (Siklus Ambang) nalika nilai ambang kasebut tekan.

Grafik ing ngisor iki kanthi jelas nuduhake hubungan antarane garis ambang lan kurva amplifikasi, ambang lan nilai Ct.

【Kepiye cara ngitung?】

Wis dibuktekake kanthi teori matematika yen nilai Ct nduweni hubungan linear terbalik karo logaritma saka jumlah template awal.Real Time PCR ngawasi produk amplifikasi PCR kanthi wektu nyata lan ngitung sajrone fase amplifikasi eksponensial.

Kanggo saben siklus PCR, DNA mundhak kanthi eksponensial kaping 2, lan ora suwe tekan dataran tinggi.

Kanthi asumsi yen jumlah wiwitan DNA yaiku A₀ , sawise n siklus, jumlah teoretis prodhuk DNA bisa ditulis minangka:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Banjur, luwih akeh jumlah DNA awal A 0, luwih cepet jumlah produk sing digedhekake tekan nilai deteksi An , lan jumlah siklus nalika tekan An yaiku nilai Ct.Tegese, luwih akeh jumlah DNA awal A 0, luwih awal kurva amplifikasi puncak, lan jumlah siklus sing dibutuhake n luwih cilik.

Kita nindakake pencairan gradien saka standar konsentrasi sing dikenal lan digunakake minangka cithakan kanggo Real Time PCR, lan seri kurva amplifikasi bakal dipikolehi kanthi interval sing padha ing urutan wiwitan jumlah DNA saka luwih nganti kurang.Miturut hubungan linear antarane nilai Ct lan logaritma nomer Cithakan wiwitan, a[kurva standar] bisa digawe .

Kanthi ngganti nilai Ct saka sampel kanthi konsentrasi sing ora dingerteni menyang kurva standar, jumlah cithakan awal saka sampel kanthi konsentrasi sing ora dingerteni bisa dipikolehi, yaiku prinsip kuantitatif Real Time PCR.

Metode Deteksi Real Time PCR

Real Time PCR ndeteksi produk amplifikasi PCR kanthi ndeteksi intensitas fluoresensi ing sistem reaksi.

Prinsip Metode Embedding Pewarna Fluorescent】

pewarna fluoresensi, kayata TB Green ® , bisa nonspecifically ikatan kanggo pindho untaian DNA ing sistem PCR lan fluoresce nalika naleni.

Intensitas fluoresensi ing sistem reaksi tambah eksponensial kanthi nambah siklus PCR.Kanthi ndeteksi intensitas fluoresensi, jumlah amplifikasi DNA ing sistem reaksi bisa dipantau ing wektu nyata, banjur jumlah cithakan wiwitan ing sampel bisa dikira-kira.

【Prinsip metode probe fluoresensi】

probe neoniku urutan asam nukleat karo klompok neon ing 5' mburi lan gugus quenching ing 3' mburi, kang khusus bisa ikatan kanggo cithakan.Nalika probe utuh, fluoresensi sing dipancarake dening fluorophore dipateni dening klompok quenching lan ora bisa fluoresce.Nalika probe wis decomposed, zat fluoresensi bakal dissociate lan emit fluoresensi.

Probe neon ditambahake menyang solusi reaksi PCR.Sajrone proses annealing, probe neon bakal ngiket posisi tartamtu saka cithakan.Sajrone proses extension, aktivitas exonuclease 5′→3′ enzim PCR bisa ngurai probe fluoresensi sing dihibridisasi karo cithakan, lan zat fluoresensi dipisahake kanggo ngetokake fluoresensi.Kanthi ndeteksi intensitas fluoresensi probe ing sistem reaksi, tujuan ngawasi jumlah amplifikasi produk PCR bisa digayuh.

【Pamilihan Metode Deteksi Fluoresensi】

Yen digunakake kanggo mbedakake urutan kanthi homologi dhuwur lan nindakake deteksi PCR multiplex kayata analisis ngetik SNP, metode probe fluoresensi ora bisa diganti.
Kanggo eksperimen PCR Real Time liyane, cara chimera fluoresensi sing prasaja, gampang lan murah bisa digunakake.

probesKekhususan sing kuat, bisa PCR multipleks

Kekurangan

Syarat spesifisitas dhuwur kanggo amplifikasi;

PCR multiplex ora bisa dileksanakake. Perlu ngrancang probe khusus, biaya dhuwur;

kadhangkala desain probe angel

Produk sing gegandhengan: