Nilai Ct minangka wangun presentasi asil paling penting saka PCR kuantitatif fluoresensi.Iki digunakake kanggo ngitung beda ekspresi gen utawa nomer salinan gen.Dadi apa nilai Ct saka kuantifikasi fluoresensi sing dianggep cukup?Kepiye mesthekake kisaran efektif saka nilai Ct?
Apa Nilai Ct?
Sajrone proses amplifikasi qPCR, jumlah siklus amplifikasi sing cocog (Batesan Siklus) nalika sinyal fluoresensi produk sing digedhekake tekan ambang fluoresensi sing disetel.C tegese Cycle lan T tegese Threshold.Cukup, nilai Ct yaiku jumlah siklus sing cocog karo nalika amplifikasi cithakan awal tekan jumlah produk tartamtu ing qPCR.Sing diarani "jumlah produk tartamtu" bakal diterangake maneh mengko.
Apa gunane nilai Ct?
1. Hubungan antarane amplifikasi eksponensial, jumlah cithakan lan nilai Ct
Saenipun, gen ing qPCR dikumpulake kanthi amplifikasi eksponensial sawise sawetara siklus tartamtu.Hubungan antarane jumlah siklus amplifikasi lan jumlah produk yaiku: Jumlah produk sing digedhekake = jumlah template awal × (1+En) nomer siklus.Nanging, reaksi qPCR ora mesthi ana ing kahanan sing cocog.Nalika jumlah produk sing dikuatake tekan "jumlah produk tartamtu", jumlah siklus ing wektu iki yaiku nilai Ct, lan ana ing periode amplifikasi eksponensial.Hubungan antarane nilai Ct lan jumlah cithakan wiwitan: Ana hubungan linear antarane nilai Ct cithakan lan logaritma nomer salinan wiwitan cithakan.Sing luwih dhuwur konsentrasi cithakan awal, sing luwih cilik nilai Ct;ngisor konsentrasi Cithakan awal, sing luwih gedhe Nilai Ct.
2. Kurva amplifikasi, ambang fluoresensi lan jumlah produk PCR tartamtu
Jumlah produk amplifikasi qPCR langsung ditampilake ing bentuk sinyal neon, yaiku kurva amplifikasi.Ing tahap awal PCR, amplifikasi ana ing kahanan sing becik, jumlah siklus cilik, akumulasi produk cilik, lan tingkat fluoresensi ora bisa dibedakake kanthi jelas saka latar mburi fluoresensi.Sawise iku, fluoresensi mundhak lan mlebu fase eksponensial.Jumlah produk PCR bisa dideteksi ing titik tartamtu nalika reaksi PCR mung ing phase eksponensial, kang bisa digunakake minangka "jumlah tartamtu saka produk", lan isi awal saka cithakan bisa deduced saka iki.Mulane, intensitas sinyal fluoresensi sing cocog karo jumlah produk tartamtu yaiku ambang fluoresensi.
Ing tahap pungkasan PCR, kurva amplifikasi ora nuduhake amplifikasi eksponensial maneh, lan mlebu fase linier lan fase dataran tinggi.
3. Reproducibility saka nilai Ct
Nalika siklus PCR tekan angka siklus saka nilai Ct, iku wis mung ngetik periode amplifikasi eksponensial bener.Ing wektu iki, kesalahan cilik durung digedhekake, saéngga reproducibility saka nilai Ct banget, yaiku, cithakan sing padha digedhekake ing wektu sing beda utawa ing tabung sing beda-beda ing wektu sing padha.Amplifikasi, nilai Ct sing dipikolehi konstan.
1. Efisiensi amplifikasi En
Efisiensi amplifikasi PCR nuduhake efisiensi polimerase ngonversi gen kanggo digedhekake dadi amplikon.Efisiensi amplifikasi nalika siji molekul DNA diowahi dadi rong molekul DNA yaiku 100%.Efisiensi amplifikasi umume ditulis minangka En.Kanggo nggampangake analisis artikel sabanjure, faktor-faktor sing mengaruhi efisiensi amplifikasi diterangake kanthi ringkes.
| Faktor sing mengaruhi | panjelasan | Carane ngadili? |
| A. Inhibitor PCR | 1. DNA cithakan ngandhut zat sing nyandhet reaksi PCR, kayata protein utawa deterjen.2. CDNA sawise transkripsi mbalikke ngandhut konsentrasi dhuwur saka cithakan RNA utawa komponen reagen RT, kang uga bisa nyandhet reaksi PCR sakteruse. | 1. Apa ana polusi bisa diadili kanthi ngukur rasio A260 / A280 lan A260 / A230 utawa RNA elektroforesis.2. Apa cDNA diencerke miturut rasio tartamtu sawise transkripsi mbalikke. |
| B. Desain primer sing ora bener | Primer ora anneal kanthi efisien | Priksa primer kanggo primer-dimer utawa jepit rambut, ora cocog, lan kadhangkala uga kalebu desain intronik. |
| C. Desain program reaksi PCR sing ora tepat | 1. Primer ora bisa èfèktif anneal2. Rilis DNA polimerase sing ora cukup 3. Aktivitas polimerase DNA suhu dhuwur jangka panjang mudhun | 1. Suhu annealing luwih dhuwur tinimbang nilai TM saka primer2. Wektu pra-denaturasi cendhak banget 3. Wektu saben tahapan prosedur reaksi dawa banget |
| D. Ora cukup nyawiji reagen utawa kesalahan pipetting | Ing sistem reaksi, konsentrasi lokal komponen reaksi PCR dhuwur banget utawa ora rata, nyebabake amplifikasi PCR sing ora eksponensial. | |
| E. Amplicon Length | Dawane amplicon dawa banget, ngluwihi 300bp, lan efisiensi amplifikasi kurang | Priksa manawa dawa amplicon ana ing antarane 80-300bp |
| F. Pengaruh reagen qPCR | Konsentrasi DNA polimerase ing reagen kurang utawa konsentrasi ion ing buffer ora dioptimalake, nyebabake aktivitas enzim Taq ora tekan maksimal. | Penentuan efisiensi amplifikasi kanthi kurva standar |
2. Range saka nilai Ct
Nilai Ct kisaran saka 15-35.Yen nilai Ct kurang saka 15, dianggep amplifikasi ana ing kisaran periode baseline lan ambang fluoresensi durung tekan.Saenipun, ana hubungan linear antarane nilai Ct lan logaritma nomer salinan awal saka cithakan, sing, kurva standar.Liwat kurva standar, nalika efficiency amplifikasi punika 100%, Nilai Ct diwilang kanggo quantifying nomer salinan siji gen watara 35. Yen luwih saka 35, nomer salinan dhisikan saka cithakan miturut teori kurang saka 1, kang bisa dianggep ora ana guna.
Kanggo macem-macem gen Ct kisaran, amarga prabédan ing nomer salinan gen lan efficiency amplifikasi ing jumlah Cithakan awal, iku perlu kanggo nggawe kurva standar kanggo gen lan ngetung sawetara linear deteksi gen.
3. Faktor sing mengaruhi nilai Ct
Saka hubungan antarane jumlah siklus amplifikasi lan jumlah produk: jumlah produk sing digedhekake = jumlah cithakan awal × (1 + En) nomer siklus, bisa dideleng yen ing kondisi becik, jumlah cithakan awal lan En bakal duwe pengaruh negatif marang nilai Ct.Bentenipun kualitas cithakan utawa efisiensi amplifikasi bakal nyebabake nilai Ct dadi gedhe utawa cilik banget.
4.Nilai Ct gedhe banget utawa cilik banget
Wektu kirim: Feb-22-2023
