Teknologi diagnosis molekuler nggunakake metode biologi molekuler kanggo ndeteksi ekspresi lan struktur materi genetik awak manungsa lan macem-macem patogen, supaya bisa nggayuh tujuan prédhiksi lan diagnosa penyakit.

Ing taun-taun pungkasan, kanthi nganyarke lan pengulangan teknologi diagnostik molekuler, aplikasi klinis diagnostik molekuler saya tambah akeh lan luwih jero, lan pasar diagnostik molekuler wis mlebu periode pangembangan kanthi cepet.

Penulis ngringkes teknologi diagnostik molekuler umum ing pasar, lan dipérang dadi telung bagean: bagean pisanan ngenalake teknologi PCR, bagean liya ngenalake teknologi amplifikasi isothermal asam nukleat, lan bagean liya ngenalake teknologi urutan.

01

Bab I: Teknologi PCR

teknologi PCR

PCR (reaksi rantai polimerase) minangka salah sawijining teknologi amplifikasi DNA in vitro, kanthi sejarah luwih saka 30 taun.

Teknologi PCR dipelopori ing taun 1983 dening Kary Mullis saka Cetus, AS.Mullis nglamar paten PCR ing taun 1985 lan nerbitake makalah akademik PCR pisanan babagan Ilmu ing taun sing padha.Mullis menangaké Bebungah Nobel Kimia ing taun 1993.

Prinsip Dasar PCR

PCR bisa nggedhekake fragmen DNA target luwih saka siji yuta kaping.Prinsip kasebut yaiku ing katalisis DNA polimerase, DNA untai induk digunakake minangka cithakan, lan primer khusus digunakake minangka titik wiwitan kanggo extension.Iki replikasi in vitro liwat langkah kayata denaturasi, annealing, lan extension.Proses DNA untai putri pelengkap DNA templat untai induk.

Proses PCR standar dipérang dadi telung langkah:

1. Denaturasi: Gunakake suhu dhuwur kanggo misahake untaian ganda DNA.Ikatan hidrogen ing antarane untaian ganda DNA rusak ing suhu dhuwur (93-98°C).

2. Annealing: Sawise DNA untai ganda dipisahake, suhu diturunake supaya primer bisa ikatan karo DNA untai tunggal.

3. Ekstensi: DNA polimerase wiwit sintesis untaian komplementer ing sadawane untaian DNA saka primer sing kaiket nalika suhu diturunake.Nalika ekstensi rampung, siklus rampung, lan jumlah pecahan DNA tikel kaping pindho.

Balesan telung langkah iki 25-35 kaping, jumlah fragmen DNA bakal nambah kanthi eksponensial.

Kepinteran PCR yaiku primer sing beda bisa dirancang kanggo gen target sing beda-beda, saengga fragmen gen target bisa digedhekake sajrone wektu sing cendhak.

Nganti saiki, PCR bisa dipérang dadi telung kategori, yaiku PCR biasa, PCR kuantitatif fluoresensi lan PCR digital.

Generasi pisanan saka PCR biasa

Gunakake instrumen amplifikasi PCR biasa kanggo nggedhekake gen target, banjur gunakake elektroforesis gel agarose kanggo ndeteksi produk, mung analisis kualitatif sing bisa ditindakake.

Kerugian utama PCR generasi pisanan:

-Rawan kanggo amplifikasi non-spesifik lan asil positif palsu.

-Deteksi mbutuhake wektu suwe lan operasi kasebut rumit.

- Mung tes kualitatif sing bisa ditindakake.

PCR kuantitatif fluoresensi generasi kapindho

PCR kuantitatif Fluoresensi (Real-Time PCR), uga dikenal minangka qPCR, digunakake kanggo ngawasi akumulasi produk sing digedhekake liwat akumulasi sinyal neon kanthi nambahake probe neon sing bisa nuduhake kemajuan sistem reaksi, lan kanggo ngadili asil liwat kurva fluoresensi, lan bisa diukur kanthi bantuan nilai Cq lan standar kurva.

Amarga teknologi qPCR ditindakake ing sistem tertutup, kemungkinan kontaminasi dikurangi, lan sinyal fluoresensi bisa dipantau kanggo deteksi kuantitatif, saengga paling akeh digunakake ing praktik klinis lan wis dadi teknologi dominan ing PCR.

Zat fluoresensi sing digunakake ing PCR kuantitatif neon nyata-nyata bisa dipérang dadi: probe neon TaqMan, beacon molekuler lan pewarna neon.

1) TaqMan neon probe:

Sajrone amplifikasi PCR, probe fluoresensi khusus ditambahake nalika nambahake sepasang primer.Probe kasebut minangka oligonukleotida, lan ujung loro kasebut dilabeli karo klompok neon reporter lan klompok neon quencher.

Nalika probe utuh, sinyal fluoresensi sing dipancarake dening klompok reporter diserap dening grup quenching;sajrone amplifikasi PCR, aktivitas exonuclease 5′-3′ enzim Taq cleaves lan degrades probe, nggawe klompok neon reporter lan quencher Klompok fluoresensi dipisahake, supaya sistem ngawasi fluoresensi bisa nampa sinyal fluoresensi, yaiku, saben-saben untaian DNA digedhèkaké, mbentuk sinyal fluoresensi sing lengkap, lan molekul fluoresensi wis digedhèkaké. produk PCR.

2) SYBR pewarna neon:

Ing sistem reaksi PCR, keluwihan pewarna neon SYBR ditambahake.Sawise pewarna fluoresensi SYBR ora digabungake sacara khusus menyang untaian ganda DNA, pewarna kasebut ngetokake sinyal fluoresensi.Molekul pewarna SYBR sing ora digabungake ing rantai ora bakal ngetokake sinyal neon, saéngga njamin sinyal neon Tambah produk PCR rampung disinkronake karo paningkatan produk PCR.SYBR mung ngiket DNA untai ganda, saengga kurva leleh bisa digunakake kanggo nemtokake manawa reaksi PCR spesifik.

3) Beacon molekuler

Iki minangka probe oligonukleotida kanthi label ganda stem-loop sing mbentuk struktur jepit rambut watara 8 basa ing 5 lan 3 ujung.Urutan asam nukleat ing ujung loro kasebut dipasangake sacara komplementer, nyebabake gugus fluoresensi lan gugus quenching dadi nyenyet.Tutup, ora bakal ngasilake fluoresensi.

Sawise produk PCR diasilake, sajrone proses annealing, bagian tengah mercusuar molekul dipasangake karo urutan DNA tartamtu, lan gen fluoresensi dipisahake saka gen quencher kanggo ngasilake fluoresensi.

Kerugian utama PCR generasi kapindho:

Sensitivitas isih kurang, lan deteksi spesimen sing kurang salinan ora akurat.

Ana pengaruh nilai latar mburi, lan asil rentan kanggo gangguan.

PCR digital generasi katelu

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ngetung nomer salinan urutan target liwat deteksi titik pungkasan, lan bisa nindakake deteksi kuantitatif absolut akurat tanpa nggunakake kontrol internal lan kurva standar.

Digital PCR nggunakake deteksi endpoint lan ora gumantung ing Nilai Ct (ambang siklus), supaya reaksi PCR digital kurang kena pengaruh dening efficiency amplifikasi, lan toleransi kanggo inhibitor reaksi PCR wis apik, karo akurasi dhuwur lan reproducibility.

Amarga karakteristik sensitivitas dhuwur lan akurasi dhuwur, ora gampang diganggu dening inhibitor reaksi PCR, lan bisa entuk kuantifikasi absolut sing bener tanpa produk standar, sing wis dadi hotspot riset lan aplikasi.

Miturut macem-macem wujud unit reaksi, bisa dipérang dadi telung jinis: sistem microfluidic, chip lan droplet.