Ing eksperimen qPCR, desain primer uga minangka tautan sing penting banget.Apa primer cocog utawa ora ana hubungane karo apa efisiensi amplifikasi tekan standar, apa produk sing digedhekake spesifik, lan apa asil eksperimen kasedhiya.
Dadi kepiye carane nggawe spesifisitas primer qPCR luwih apik?Efisiensi amplifikasi dhuwur?
Dina iki, kita bakal nggawa sampeyan kanggo ngrancang primer qPCR bebarengan, lan supaya desain primer qPCR dadi skill lore sing efisien ing eksperimen.
Nalika ngrancang primer qPCR, biasane mbayar manungsa waé menyang TCTerms ing ngisor iki: primers kudu dirancang ing sabisa introns, dawa produk kudu 100-300 bp, Nilai Tm kudu cedhak 60 ° C, lan primers hulu lan hilir kudu cedhak sabisa, lan mburi primer kudu G utawa C, etc.
1. Desain primer spanning intron
Nalika ngrancang primer qPCR, milih primer sing dirancang ing antarane intron bisa nyegah cithakan gDNA digedhekake, lan produk kasebut kabeh asale saka amplifikasi cDNA, saéngga ngilangi pengaruh kontaminasi gDNA.
2. Dawane primer
Dawane sepisanan umume antarane 18-30 nt, lan dawa produk amplifikasi kudu dikontrol antarane 100-300 bp sabisa.
Yen sepisanan cendhak banget, bakal nyebabake amplifikasi sing ora spesifik, lan yen dawa banget, bakal gampang mbentuk struktur sekunder (kayata struktur jepit rambut).Yen produk amplifikasi dawa banget, ora cocok kanggo reaksi polimerase, sing bakal mengaruhi efisiensi amplifikasi PCR.
3. Isi GC lan nilai Tm
Isi GC saka primer kudu dikontrol antarane 40% lan 60%.Yen dhuwur banget utawa kurang, ora kondusif kanggo miwiti reaksi.Isi GC saka primer maju lan mbalikke kudu cedhak padha supaya diwenehi nilai Tm padha lan suhu anil.
Nilai Tm kudu ana ing antarane 55-65°C sabisa-bisa, umume watara 60°C, lan nilai Tm hulu lan hilir kudu cedhak, luwih becik ora luwih saka 4°C.
4. Aja milih A ing 3′ mburi primer
Nalika 3 'mburi sepisanan punika mismatched, ana beda gedhe ing efficiency sintesis basa beda.Nalika basa pungkasan iku A, uga bisa miwiti sintesis chain malah ing cilik saka mismatching, lan nalika basa pungkasan T Nalika, efficiency induksi mismatch wis suda banget.Mulane, coba aja milih A ing mburi 3′ primer, lan luwih becik milih T.
Yen sepisanan probe, 5′ mburi probe ora bisa dadi G, amarga sanajan basis G siji disambungake menyang FAM kelompok reporter neon, G uga bisa quench sinyal neon cemlorot dening klompok FAM, asil ing asil negatif palsu.Muncul.
5. Distribusi dhasar
Distribusi papat basa ing primer luwih disenengi kanthi acak, ngindhari luwih saka 3 G utawa C berturut-turut ing mburi 3′, lan luwih saka 3 berturut-turut.G utawa C gampang kanggo generate pasangan ing wilayah urutan sugih GC.
6. Wilayah desain primer kudu nyegah struktur sekunder sing kompleks.
Struktur sekunder sing dibentuk dening untaian tunggal produk amplifikasi bakal mengaruhi kelancaran PCR.Kanthi prédhiksi manawa ana struktur sekunder ing urutan target sadurunge, coba nyingkiri wilayah kasebut ing desain primer.
7. Primer dhewe lan ing antarane primer kudu ngindhari dhasar pelengkap sing terus-terusan.
Ora ana komplementaritas 4 basa sing berturut-turut antarane primer dhewe lan primer.Primer dhewe ora kudu duwe urutan pelengkap, yen ora bakal melu dhewe kanggo mbentuk struktur jepit rambut, sing bakal mengaruhi kombinasi annealing primer lan cithakan.
Urutan komplementer ora bisa ana ing antarane primer hulu lan hilir.Komplementaritas antarane primer bakal ngasilake dimer primer, sing bakal nyuda efisiensi PCR lan malah mengaruhi akurasi kuantitatif.Yen struktur primer-dimer lan jepit rambut ora bisa dihindari, nilai △G ngirim ora dhuwur banget (kudu kurang saka 4,5 kkal/mol).
8. Primer nggedhekake produk tartamtu target.
Tujuan utama deteksi qPCR yaiku kanggo mangerteni kelimpahan gen target.Yen amplifikasi non-spesifik dumadi, kuantifikasi bakal ora akurat.Mulane, sawise primer dirancang, kudu diuji dening BLAST, lan kekhususan produk dibandhingake ing database urutan.
Sabanjure, kita njupuk gen manungsa GAS6 (Growth arrest specific 6) minangka conto kanggo ngrancang primer qPCR.
01 pitakon gene
Homo GAS6liwat NCBI.Ing kene, kita kudu menehi perhatian kanggo mbandhingake jeneng gen lan spesies kanggo mesthekake yen padha konsisten.
02 Golek urutan gen
(1) Yen urutan target yaiku DNA genom, pilih sing pisanan, yaiku urutan DNA genomik saka gen kasebut.
(2) Yen urutan target mRNA, pilih sing kapindho.Sawise ngetik, klik "CDS" ing tabel ing ngisor iki.Urutan latar mburi coklat minangka urutan pengkodean gen.
03 Desain dhasar
Ketik antarmuka Primer-BLAST
Ketik nomer urutan gen utawa urutan ing format Fasta ing sisih kiwa ndhuwur, lan isi paramèter sing cocog.

Klik "Get primers" lan NCBI bakal pop munggah kanggo pitutur marang kowe sing pilihan parameter kuwi bakal digedhèkaké kanggo varian splicing liyane.Kita bisa mriksa varian splicing beda lan ngirim kanggo njaluk pasangan primer cocok (minangka ditampilake ing tokoh ngisor).Proses iki bisa njupuk puluhan detik kanggo mbukak.
Suhu anil saka pasangan primer iki watara 60°C.Miturut tujuan eksperimen, pilih primer kanthi dawa moderat, kekhususan sing apik lan kurang pelengkap dhasar kanggo eksperimen, lan tingkat sukses cukup dhuwur!
04 Verifikasi spesifikasi primer
Nyatane, saliyane kanggo ngrancang primer, Primer-Blast uga bisa ngevaluasi primer sing dirancang dhewe.Bali menyang kaca desain primer, ketik primer hulu lan hilir sing kita rancang, lan paramèter liyane ora bakal diatur.Sawise ngirim, sampeyan bisa ndeleng manawa pasangan primer uga ana ing gen liyane.Yen kabeh mau ditampilake ing gen sing pengin digedhekake, nuduhake yen kekhususan pasangan primer iki apik!(Contone, iki mung asil saka pitakonan primer!)

05 Pangadilan kualitas primer
Apa jenis primer minangka primer "sampurna" sing nggabungake "efisiensi amplifikasi nganti standar", "karakteristik produk sing digedhekake", lan "asil eksperimen sing bisa dipercaya"?
Efisiensi amplifikasi

kurva leleh
Efisiensi amplifikasi primer tekan 90% -110%, tegese efisiensi amplifikasi apik, lan kurva leleh duwe puncak siji lan biasane Tm> 80 ° C, tegese spesifisitas amplifikasi apik.
 
Produk sing gegandhengan:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Nyata Wektu PCR Gampang-Taqman