PCR kuantitatif fluoresensi (uga dikenal minangka PCR TaqMan, sing sabanjure diarani FQ-PCR) yaiku teknologi kuantitatif asam nukleat anyar sing dikembangake dening PE (Perkin Elmer) ing Amerika Serikat ing taun 1995. Teknologi iki adhedhasar PCR konvensional kanthi nambahake probe berlabel fluoresensi.Dibandhingake karo PCR fleksibel, FQ-PCR nduweni akeh kaluwihan kanggo mujudake fungsi kuantitatif.Artikel iki arep njlèntrèhaké kanthi ringkes karakteristik, prinsip, cara, lan aplikasi teknologi kasebut.
1 Fitur
FQ-PCR ora mung nduweni sensitivitas dhuwur saka PCR biasa, nanging uga amarga aplikasi probe neon, bisa langsung ndeteksi owah-owahan sinyal neon sak amplifikasi PCR liwat sistem konduksi fotoelektrik kanggo njupuk asil kuantitatif, kang ngatasi akeh shortcomings saka PCR conventional, supaya uga nduweni specificity dhuwur saka teknologi DNA hibridisasi lan akurasi dhuwur.
Contone, produk PCR umum kudu diamati kanthi elektroforesis gel agarose lan pewarnaan etidium bromida kanthi sinar ultraviolet utawa kanthi elektroforesis gel polyacrylamide lan pewarnaan perak.Iki ora mung mbutuhake macem-macem instrumen, nanging uga mbutuhake wektu lan gaweyan.Noda sing digunakake Ethidium bromide mbebayani kanggo awak manungsa, lan prosedur eksperimen sing rumit iki menehi kesempatan kanggo polusi lan positip palsu.Nanging, FQ-PCR mung perlu kanggo mbukak tutup sapisan sak loading sampel, lan proses sakteruse rampung tutup-tabung operasi, kang ora mbutuhake PCR post-Processing, Nyingkiri akeh drawbacks ing operasi PCR conventional.Eksperimen kasebut umume nggunakake siklus termal PCR ABI7100 sing dikembangake dening perusahaan PE.
Instrumen kasebut nduweni karakteristik ing ngisor iki: ① Aplikasi sing wiyar: Bisa digunakake kanggo kuantifikasi produk PCR DNA lan RNA, riset ekspresi gen, deteksi patogen, lan optimalisasi kondisi PCR.② Prinsip kuantitatif unik: Nggunakake probe label fluoresensi, jumlah fluoresensi bakal nglumpukake karo siklus PCR sawise eksitasi laser, supaya bisa nggayuh tujuan kuantifikasi.③ Efisiensi kerja sing dhuwur: Built-in 9600 PCR termal cycler, komputer dikontrol 1 nganti 2 jam kanggo ngrampungake amplifikasi lan kuantifikasi 96 conto kanthi otomatis lan sinkron.④ Ora perlu kanggo elektroforesis gel: Ora perlu kanggo dilute lan elektroforesis sampel, mung nggunakake probe khusus kanggo ndeteksi langsung ing tabung reaksi.⑤Ora ana polusi ing pipa: Tabung reaksi lan sistem konduksi fotoelektrik sing unik diadopsi, dadi ora perlu kuwatir babagan polusi.⑥Asil bisa direproduksi: kisaran dinamis kuantitatif nganti limang ordo magnitudo.Mulane, wiwit teknologi iki kasil dikembangake, wis dihargai dening akeh peneliti ilmiah lan wis ditrapake ing pirang-pirang lapangan.
2 Prinsip lan metode
Prinsip kerja FQ-PCR yaiku nggunakake aktivitas exonuclease 5′→3′ enzim Taq kanggo nambah probe berlabel fluoresensi menyang sistem reaksi PCR.Probe khusus bisa hibridisasi karo cithakan DNA sing ana ing urutan primer.Ujung 5'probe kasebut diwenehi label karo gen emisi fluoresensi FAM (6-carboxyfluorescein, puncak emisi fluoresensi ing 518nm), lan ujung 3'dilabeli karo grup quenching fluoresensi TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, puncak emisi fluoresensi ing 582 probe saka 582 emisi probe ing 582 probe). probe saka kang lengkap sak amplifikasi PCR.Nalika probe tetep utuh, grup quencher nyuda emisi fluoresensi saka grup emitting.Sawise klompok emitting dipisahake saka klompok quenching, inhibisi diangkat, lan Kapadhetan optik ing 518nm mundhak lan dideteksi dening sistem deteksi fluoresensi. Ing phase renaturation, probe hybridizes karo DNA cithakan, lan enzim Taq ing phase extension gerakane bebarengan cithakan DNA karo extension saka primer.Nalika probe dipotong, efek quenching diluncurake lan sinyal neon dibebasake.Saben-saben cithakan disalin, probe dipotong, diiringi sinyal fluoresensi.Amarga ana hubungan siji-kanggo-siji antarane jumlah fluorofor sing dirilis lan jumlah produk PCR, teknik iki bisa digunakake kanggo ngitung cithakan kanthi akurat.Instrumen eksperimen umume nggunakake cycler termal ABI7100 PCR sing dikembangake dening perusahaan PE, lan siklus termal liyane uga bisa digunakake.Yen sistem reaksi jinis reaksi ABI7700 digunakake kanggo eksperimen, sawise reaksi rampung, asil kuantitatif bisa langsung diwenehake liwat analisis komputer.Yen sampeyan nggunakake siklus termal liyane, sampeyan kudu nggunakake detektor fluoresensi kanggo ngukur sinyal fluoresensi ing tabung reaksi ing wektu sing padha kanggo ngetung RQ +, RQ-, △RQ.RQ + nggantosi rasio saka intensitas luminescence saka klompok emisi neon saka tabung sampel kanggo intensitas luminescence saka klompok quenching, RQ- nggantosi rasio saka loro ing tabung kosong, △RQ (△RQ = RQ + -RQ-) nggantosi jumlah owah-owahan sinyal fluoresensi sak PCR Sawise asil Processing data bisa quantitative.Amarga introduksi probe fluoresensi, kekhususan eksperimen saya tambah akeh.Desain probe umume kudu ketemu kondisi ing ngisor iki: ①Dawa probe kudu kira-kira 20-40 basa kanggo mesthekake spesifik saka naleni.②Isi basa GC antara 40% lan 60% kanggo nyegah duplikasi urutan nukleotida tunggal.③ Aja hibridisasi utawa tumpang tindih karo primer.④ Stabilitas ikatan antarane probe lan cithakan luwih gedhe tinimbang stabilitas ikatan antarane primer lan cithakan, mula nilai Tm probe kudu paling sethithik 5°C luwih dhuwur tinimbang nilai Tm primer.Kajaba iku, konsentrasi probe, homologi antarane probe lan urutan cithakan, lan jarak antarane probe lan primer kabeh duwe pengaruh ing asil eksperimen.
produk sing gegandhengan:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Produsen lan Supplier |Foregene (foreivd.com)
Wektu kirim: Oct-15-2021
