Verifikasi kinerja primer lan probe ing tahap awal reagen PCR lan nemtokake kahanan reaksi sing paling cocog minangka prasyarat kanggo njamin kelancaran eksperimen formal.
Dadi, kepiye kita kudu ngonfirmasi probe primer ing tahap awal?
Indikator utama yaiku garis dasar, kurva amplifikasi, nilai ct, efisiensi amplifikasi, deteksi sampel konsentrasi rendah, CV, lsp.
Baseline
Baseline minangka garis horisontal ing kurva amplifikasi PCR.Ing sawetara siklus pisanan reaksi amplifikasi PCR, sinyal fluoresensi ora owah akeh lan mbentuk garis lurus.Garis lurus iki minangka garis dasar.
Nalika screening probe primer PCR, priksa manawa garis dasar iku level.Kemurnian konsentrasi probe primer bakal mengaruhi garis dasar, kayata nyebabake garis dasar munggah utawa mudhun.Baseline uga minangka indikator sing intuisi banget.
Kurva Amplifikasi
Indikator intuisi liyane yaiku wangun kurva amplifikasi.Luwih becik duwe kurva S-shaped kanggo ngindhari amplifikasi sekunder utawa kurva amplifikasi abnormal liyane.
Nilai Ct
Jumlah siklus sing cocog karo titik infleksi saka garis dasar nganti pertumbuhan eksponensial yaiku nilai Ct.
Kanggo conto sing padha, probe primer sing beda nyebabake kurva amplifikasi sing beda, lan nilai Ct sing cocog bakal kena pengaruh efisiensi amplifikasi lan gelar interferensi.Ing teori, luwih cilik nilai Ct saka probe primer sing kita pilih, luwih apik.
Efisiensi Amplifikasi
Salah sawijining cara sing paling dipercaya lan stabil kanggo ngevaluasi efisiensi amplifikasi PCR yaiku kurva standar, sing uga diakoni sacara umum dening para peneliti.Cara kasebut kalebu nggawe seri conto kanggo ngontrol jumlah cithakan target.Sampel iki biasane digawe dening pengenceran serial saka solusi stok konsentrasi, sing paling umum digunakake yaiku pengenceran 10 kali.Nggunakake seri saka sampel diencerke, nggunakake program qPCR standar kanggo nggedhekake kanggo njupuk Nilai Cq, lan pungkasanipun tarik kurva standar miturut konsentrasi saben sampel lan Nilai Cq cocog kanggo diwenehi persamaan linear Cq = -klgX0 + b, lan efficiency amplifikasi E = 10 (-1 / k) -1.Nalika nggunakake qPCR kanggo analisis kuantitatif, efisiensi amplifikasi kudu ana ing kisaran 90% -110% (3.6>k>3.1).
Deteksi Sampel konsentrasi rendah
Nalika konsentrasi sampel kurang, tingkat deteksi probe primer beda-beda.Kita milih 20 conto konsentrasi rendah kanggo ditiru, lan sistem probe primer kanthi tingkat deteksi paling dhuwur yaiku sing paling apik.
Koefisien Variasi (CV)
10 conto duplikat bisa dideteksi kanthi probe primer sing beda miturut standar baris reagen kanggo deteksi amplifikasi asam nukleat.
Reagen kuantitatif:
Akurasi
Akurasi ing siji kumpulan kudu ketemu: koefisien variasi (CV,%) saka nilai logaritma konsentrasi tes yaiku ≤5%.Nalika konsentrasi sampel kurang, koefisien variasi (CV,%) saka logaritma konsentrasi deteksi yaiku ≤10%
Reagen kualitatif:
Akurasi
Akurasi ing siji batch kudu ketemu:
(1) Koefisien variasi nilai Ct (CV,%) ≤5%
Sampel sing padha dites podo karo kaping 10, lan asil tes kudu konsisten
Wektu kirim: Sep-18-2021
