Ing tahap awal wabah, amarga perkembangan sing cepet, diagnosis cepet pasien sing dicurigai minangka kunci kanggo nyegah COVID-19.Sawetara reagen deteksi asam nukleat sing disetujoni duwe wektu pangembangan sing cendhak, lan ana masalah kayata konfirmasi kinerja sing cepet, optimasi reagen sing ora cukup, lan bedane gedhe ing antarane batch;Masalah saka macem-macem laboratorium klinis ing macem-macem aspek proses deteksi asam nukleat bisa uga mengaruhi akurasi asil deteksi asam nukleat.Artikel iki bakal fokus ing pranala lan poin utama ing deteksi asam nukleat SARS-CoV-2 saiki, lan nganalisa masalah pemeriksaan negatif palsu lan positif babagan deteksi asam nukleat laboratorium lan inkonsistensi klinis.

Prinsip deteksi asam nukleat SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 minangka virus RNA kanthi urutan genom udakara 29 kb, kanthi 10 gen, sing bisa ngode 10 protein kanthi efektif.Virus dumadi saka RNA lan protein, lan lapisan paling njaba yaiku lapisan njaba sing kasusun saka lipid lan glikoprotein.Ing njero, kapsid protein mbungkus RNA ing njero, saéngga nglindhungi RNA sing gampang rusak (P1).

P1 Struktur SARS-COV-2

Virus nyerang sel liwat reseptor permukaan sel tartamtu kanggo nyebabake infeksi, lan nggunakake sel inang kanggo niru.

Prinsip deteksi asam nukleat virus yaiku mbabarake RNA virus liwat lisat sel, lan banjur nggunakake reaksi berantai transkripsi-polimerase fluoresens wektu nyata (RT-PCR) kanggo deteksi.

Kunci prinsip deteksi yaiku nggunakake primer lan probe kanggo nggayuh "pencocokan target" urutan asam nukleat, yaiku, nemokake urutan asam nukleat SARS-CoV-2 sing beda karo virus liyane ing udakara 30.000 basa (persamaan asam nukleat karo virus liyane) area "Low"), desain primer lan probe.

Primer lan probe cocog banget karo wilayah spesifik asam nukleat SARS-CoV-2, yaiku, spesifik banget.Sawise asil amplifikasi RT-PCR fluoresensi nyata-nyata saka sampel sing bakal diuji positif, iki mbuktekake manawa SARS-CoV-2 ana ing conto kasebut.Waca P2.

P2 Langkah-langkah penentuan asam nukleat SARS-CoV-2 (RT-PCR fluoresen wektu nyata)

Kahanan lan syarat laboratorium kanggo deteksi asam nukleat SARS-CoV-2

Laboratorium uji asam nukleat minangka sing paling cocog kanggo lingkungan tekanan negatif, lan kudu menehi perhatian marang pemantauan tekanan, njaga aliran udara, lan ngilangi aerosol.Personel pengujian asam nukleat kudu nduweni kualifikasi sing cocog, nampa latihan reaksi rantai polimerase sing relevan lan lulus penilaian.Laboratorium kasebut kudu dikelola kanthi ketat, diselehake ing papan, lan personel sing ora ana gandhengane dilarang mlebu.Wilayah sing resik kudu ventilasi lan disinfeksi ing papan kasebut.Item sing relevan diselehake ing zona, resik lan reged dipisahake, diganti ing wektu, lan dekontaminasi ing panggonan.Disinfeksi rutin: Disinfektan sing ngemot klorin minangka solusi utama kanggo wilayah sing luwih gedhe, lan alkohol 75% bisa digunakake kanggo wilayah cilik.Cara sing apik kanggo ngatasi aerosol yaiku mbukak jendhela kanggo ventilasi, lan disinfeksi udara uga bisa ditindakake kanthi sinar ultraviolet, filtrasi, lan disinfeksi udara.

Tautan utama lan paramèter penentuan asam nukleat SARS-CoV-2 (RT-PCR fluoresensi wektu nyata)

Sanajan laboratorium umume menehi perhatian marang "deteksi" asam nukleat, nyatane, "ekstraksi" asam nukleat uga minangka salah sawijining langkah kunci kanggo deteksi sing sukses, sing ana hubungane karo pangumpulan lan panyimpenan conto virus.

Saiki, conto pernapasan sing paling akeh digunakake, kayata swab nasopharyngeal, nggunakake cara liya, yaiku solusi inaktivasi (pengawetan) sing disiapake adhedhasar ekstraksi asam nukleat lan larutan lisis.Ing tangan siji, solusi pengawetan virus iki bisa denaturasi protein virus, ilang aktivitas lan ora infèksius maneh, lan nambah safety saka transportasi lan tataran deteksi;ing tangan liyane, bisa langsung kokain virus kanggo ngeculake asam nukleat, ngilangke enzim decomposing asam nukleat, lan nyegah virus.RNA rusak.

Solusi sampling virus sing disiapake kanthi basis solusi lisis ekstraksi asam nukleat.Komponen utama yaiku uyah imbang, agen chelating asam ethylenediaminetetraacetic, uyah guanidine (guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, lan liya-liyane), surfaktan anionik (dodecane) Sodium sulfate), surfaktan kationik (tetradecyl trimethyl ammonium oxalate), fenol, komponen liyane 8-thixyoquinase lan protein liyane.Saiki, ana akeh jinis kit ekstraksi asam nukleat, lan macem-macem ekstraksi asam nukleat lan reagen pemurnian digunakake.Sanajan ekstraksi asam nukleat lan reagen pemurnian sing padha digunakake, prosedur ekstraksi saben kit beda-beda.

Saiki, produk kit deteksi asam nukleat sing disetujoni dening Administrasi Produk Medis Nasional dipilih adhedhasar gen ORF1ab, E lan N ing genom SARS-CoV-2.Prinsip deteksi produk sing beda-beda pancen padha, nanging desain primer lan probe beda.Ana segmen target tunggal (ORF1ab), segmen target ganda (ORF1ab, N utawa E), lan segmen target telu (ORF1ab, N lan E).Bentenipun antarane deteksi lan interpretasi, ekstraksi asam nukleat lan sistem reaksi RT-PCR neon nyata-nyata kudu ngrujuk marang instruksi kit sing cocog, lan disaranake pangguna strictly tindakake cara interpretasi kasebut ing instruksi kit kanggo interpretasi.Wilayah umum, primer lan urutan probe sing digedhekake dening RT-PCR neon wektu nyata ditampilake ing P3.

P3 Lokasi target amplikon SARS-CoV-2 ing genom lan urutan primer lan probe

Interpretasi asil penentuan asam nukleat SARS-CoV-2 (Real-Tneon RT-PCR)

"Rencana Nyegah lan Kontrol Pneumonia kanggo Infeksi SARS-CoV-2 (Edisi Kapindho)" kanggo pisanan njlentrehake kritéria kanggo ngadili asil amplifikasi gen tunggal:

1. Ora Ct utawa Ct≥40 negatif;

2. Ct<37 positif;

3. Nilai Ct 37-40 minangka area skala abu-abu.Dianjurake kanggo mbaleni eksperimen.Yen asil redoing Ct <40 lan kurva amplifikasi duwe puncak sing jelas, sampel kasebut dianggep positif, yen ora negatif.

Pandhuan edisi kaping telu lan pandhuan edisi kaping papat nerusake kriteria ing ndhuwur.Nanging, amarga beda target sing digunakake ing kit komersial, pandhuan edisi kaping 3 sing kasebut ing ndhuwur ora menehi kritéria kanggo nemtokake kombinasi target, nandheske Instruksi sing diwenehake dening pabrikan bakal ditindakake.Wiwit saka pedoman edisi kaping lima, rong target wis dijlentrehake, utamane kriteria penilaian kanggo target tunggal sing angel ditimbang.Yaiku, yen laboratorium pengin konfirmasi manawa ana kasus positif kanggo deteksi asam nukleat SARS-CoV-2, ing ngisor iki kudu dipenuhi 1 saka 2 kahanan:

(1) Loro target SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) ing sampel sing padha dites positif dening RT-PCR neon wektu nyata.Yen target siji positif, re-sampling lan tes maneh dibutuhake.Yen asil tes kasebut Yen target siji isih positif, dianggep positif.

(2) Rong conto RT-PCR neon nyata-nyata nuduhake target siji positif ing wektu sing padha utawa rong conto saka jinis sing padha nuduhake asil tes positif target siji, sing bisa dianggep positif.Nanging, pedoman kasebut uga negesake manawa asil negatif saka tes asam nukleat ora bisa ngilangi infeksi SARS-CoV-2.Faktor sing bisa nyebabake negatif palsu kudu diilangi, kalebu kualitas sampel sing ora apik (conto pernapasan saka oropharynx lan bagean liyane), koleksi sampel banget awal utawa kasep, Sampel ora disimpen, diangkut, lan diproses kanthi bener, lan teknologi kasebut duwe masalah (variasi virus, inhibisi PCR), lsp.

Panyebab negatif palsu ing deteksi SARS-CoV-2

Konsep "negatif palsu" ing tes asam nukleat sing saiki dadi prihatin, asring nuduhake "negatif palsu" sing asil tes asam nukleat ora konsisten karo manifestasi klinis, yaiku, gejala klinis lan asil pencitraan dicurigai banget saka COVID-19, nanging tes asam nukleat tansah "negatif" kaping pirang-pirang.Pusat Laboratorium Klinis Komisi Kesehatan Nasional nerangake tes SARS-CoV-2 "negatif palsu".

(1) Ana jumlah virus tartamtu ing sel wong sing kena infeksi.Data sing wis ana nuduhake yen sawise awak kena infeksi virus, virus kasebut mlebu ing tenggorokan liwat irung lan tutuk, banjur menyang trakea lan bronkus, banjur tekan alveoli.Wong sing kena infeksi bakal ngalami periode inkubasi, gejala sing entheng, banjur proses gejala sing abot, lan tahapan penyakit sing beda.Lan jumlah virus sing ana ing macem-macem bagean awak beda-beda.

Ing babagan viral load jinis sel, sel epitel alveolar (saluran pernapasan ngisor)> sel epitel saluran napas (saluran pernapasan ndhuwur)> fibroblas, sel endotel, lan makrofag, lan liya-liyane;saka jinis sampel, cairan lavage alveolar (paling Excellent)>sputum batuk jero> swab nasofaring> swab oropharyngeal> getih.Kajaba iku, virus uga bisa dideteksi ing feces.Nanging, ngelingi penak operasi lan ditampa pasien, urutan sampel klinis sing umum digunakake yaiku swab oropharyngeal> swab nasopharyngeal> cairan lavage bronkial (operasi kompleks) lan sputum jero (biasane batuk garing, angel dipikolehi).

Mulane, jumlah virus ing sel oropharynx utawa nasopharynx sawetara pasien cilik utawa sithik banget.Yen mung conto oropharynx utawa nasopharynx sing dijupuk kanggo dites, asam nukleat virus ora bakal dideteksi.

(2) Ora ana sel sing ngemot virus sing diklumpukake sajrone koleksi sampel, utawa asam nukleat virus ora diawetake kanthi efektif.

[① Situs koleksi sing ora bener, contone, nalika ngumpulake swab oropharyngeal, ambane koleksi ora cukup, swab nasofaring sing diklumpukake ora diklumpukake ing jero rongga irung, lsp. Umume sel sing diklumpukake bisa dadi sel sing bebas virus;

②Sampling swab digunakake salah.Contone, serat sintetik kayata serat PE, serat poliester lan serat polipropilena dianjurake kanggo bahan kepala swab.Serat alam kayata katun digunakake ing operasi nyata (adsorpsi kuwat saka protein lan ora gampang kanggo wisuh metu) Lan serat nilon (panyerepan banyu miskin, anjog kanggo volume sampling ora cukup);

③Penggunaan tabung panyimpenan virus sing ora bener, kayata nyalahi panggunaan tabung panyimpenan plastik polipropilena utawa polietilena sing gampang nyerep asam nukleat (DNA/RNA), sing nyebabake nyuda konsentrasi asam nukleat ing solusi panyimpenan.Ing praktik, disaranake nggunakake plastik polimer polietilen-propilena lan sawetara wadhah plastik polipropilena sing diolah khusus kanggo nyimpen asam nukleat virus.]

[① Situs koleksi sing ora bener, contone, nalika ngumpulake swab oropharyngeal, ambane koleksi ora cukup, swab nasofaring sing diklumpukake ora diklumpukake ing jero rongga irung, lsp. Umume sel sing diklumpukake bisa dadi sel sing bebas virus;

②Sampling swab digunakake salah.Contone, serat sintetik kayata serat PE, serat poliester lan serat polipropilena dianjurake kanggo bahan kepala swab.Serat alam kayata katun digunakake ing operasi nyata (adsorpsi kuwat saka protein lan ora gampang kanggo wisuh metu) Lan serat nilon (panyerepan banyu miskin, anjog kanggo volume sampling ora cukup);

③Penggunaan tabung panyimpenan virus sing ora bener, kayata nyalahi panggunaan tabung panyimpenan plastik polipropilena utawa polietilena sing gampang nyerep asam nukleat (DNA/RNA), sing nyebabake nyuda konsentrasi asam nukleat ing solusi panyimpenan.Ing praktik, disaranake nggunakake plastik polimer polietilen-propilena lan sawetara wadhah plastik polipropilena sing diolah khusus kanggo nyimpen asam nukleat virus.]

(4) Operasi laboratorium klinis ora standar.Kahanan transportasi lan panyimpenan conto, operasi standar laboratorium klinis, interpretasi asil lan kontrol kualitas minangka faktor kunci kanggo njamin akurasi lan linuwih asil tes.Miturut asil evaluasi kualitas eksternal sing ditindakake dening Pusat Laboratorium Klinis Komisi Kesehatan Nasional tanggal 16-24 Maret 2020, saka 844 laboratorium sing entuk asil sing bener, 701 (83,1%) nduweni kualifikasi, lan 143 (16,9%) ora.Kualifikasi, kondisi tes laboratorium sakabèhé apik, nanging laboratorium sing beda-beda isih beda karo kemampuan operasi personel, kemampuan interpretasi sampel positif siji-target, lan kontrol kualitas.

Kepiye cara nyuda negatif palsu saka deteksi asam nukleat SARS-CoV-2?

Ngurangi negatif palsu ing deteksi asam nukleat kudu dioptimalake saka papat aspek ngasilake negatif palsu.

(1) Ana jumlah virus tartamtu ing sel wong sing kena infeksi.Konsentrasi virus ing macem-macem bagean awak sing dicurigai kena infeksi bakal beda ing wektu sing beda.Yen ora ana pharynx, bisa uga ana ing cairan lavage bronkial utawa feces.Yen sawetara jinis conto bisa diklumpukake bebarengan utawa ing macem-macem orane tumrap sekolah saka kemajuan penyakit kanggo testing, Bakal bantuan supaya negatif palsu.

(2) Sèl sing ngemot virus kudu diklumpukake sajrone koleksi sampel.Masalah iki bisa ditanggulangi kanthi akeh kanthi nguatake latihan kolektor sampel.

(3) Reagen IVD sing dipercaya.Kanthi nindakake riset babagan evaluasi kinerja deteksi reagen ing tingkat nasional, lan ngrembug masalah sing ana, efisiensi deteksi reagen bisa luwih apik lan sensitivitas analisis bisa ditingkatake.

(4) Operasi standar laboratorium klinis.Kanthi nguatake latihan personel laboratorium, terus-terusan ningkatake sistem manajemen kualitas laboratorium, njamin divisi sing cukup, lan ningkatake kemampuan personel kanggo ndeteksi, bisa nyuda negatif palsu amarga operasi laboratorium sing ora bener.

Alasan kanggo tes maneh positif saka tes asam nukleat SARS-CoV-2 ing pasien sing pulih lan dibuwang

"Rencana Diagnosis lan Perawatan COVID-19 (Edisi Ketujuh Uji Coba)" kanthi jelas nemtokake manawa salah sawijining kritéria kanggo pasien COVID-19 sing bisa diobati lan dibuwang saka rumah sakit yaiku rong conto saluran pernapasan sing berturut-turut duwe tes asam nukleat negatif (paling ora 24 jam), nanging ana sawetara pasien SARS-CoV-2 ing tes asam nukleat positif maneh.

(1)SARS-CoV-2 iku virus anyar.Sampeyan kudu luwih ngerti mekanisme patogen, gambaran lengkap penyakit sing disebabake lan karakteristik penyakit kasebut.Mulane, ing tangan siji, perlu kanggo nguatake manajemen pasien sing dibuwang lan nindakake observasi medis 14 dina.Nindakake tindak lanjut, ngawasi kesehatan lan tuntunan kesehatan kanggo njlentrehake pangerten babagan kabeh proses kedadeyan, pangembangan lan akibat saka penyakit kasebut.

(2) Pasien bisa uga kena infeksi virus maneh.Akademisi Zhong Nanshan ujar: Amarga pasien sing diobati duwe antibodi, SARS-CoV-2 bisa diilangi dening antibodi nalika nyerang maneh.Ana macem-macem alasan, sing bisa dadi penyebab pasien pulih, utawa bisa uga ana hubungane karo mutasi virus, utawa malah sabab saka tes laboratorium.Yen virus kasebut dhewe, mutasi SARS-CoV-2 bisa nyebabake antibodi sing diasilake pasien sing wis pulih ora efektif nglawan virus sing dimutasi.Yen pasien kena infeksi virus mutasi maneh, tes asam nukleat bisa uga positif maneh.

(3) Ing babagan cara tes laboratorium, saben metode tes duwe watesan.Deteksi asam nukleat SARS-CoV-2 amarga pilihan urutan gen, komposisi reagen, sensitivitas metode lan alasan liyane, sing nyebabake kit sing ana duwe watesan deteksi sing luwih murah.Sawise pasien diobati, virus ing awak mudhun.Nalika viral load ing sampel sing bakal diuji ana ing sangisore wates deteksi ngisor, asil "negatif" bakal katon.Nanging, asil iki ora ateges virus ing awak wis ilang.Virus kasebut bisa uga sawise perawatan mandheg.Resurgence”, terus nyalin.Mulane, dianjurake kanggo mriksa sepisan seminggu sajrone 2 nganti 4 minggu sawise discharge.

(4) Asam nukleat minangka materi genetik virus.Virus kasebut tiwas sawise pasien ngalami perawatan antivirus, nanging sisa fragmen RNA virus isih disimpen ing awak manungsa, lan ora dibuwang saka awak.Kadhangkala, ing kahanan tartamtu, bisa luwih disimpen.Suwe-suwe, lan ing wektu iki tes asam nukleat bakal "transient" positif.Kanthi perpanjangan wektu pemulihan pasien, sawise pecahan RNA residual ing awak mboko sithik, asil tes asam nukleat bisa dadi negatif.

(5) Asil tes asam nukleat saka SARS-CoV-2 mung mbuktekake anane utawa ora ana RNA virus, lan ora bisa mbuktekake aktivitas virus lan manawa virus kasebut bisa ditularake.Perlu kanggo mbuktekake manawa pasien sing duwe tes asam nukleat positif maneh bakal dadi sumber infeksi maneh.Sampeyan perlu kanggo nindakake budaya virus ing conto klinis lan cultivate virus "urip" kanggo mbuktekaken sing iku infèksius.

Ringkesan

Ringkesan, tes asam nukleat SARS-CoV-2 negatif palsu, tes positif maneh, lan kahanan liyane sing ora konsisten karo manifestasi klinis ora bisa dihindari.Ing screening lan tes nyata, disaranake nggabungake gejala klinis, pemeriksaan imaging (CT) lan eksperimen Tes laboratorium (tes asam nukleat + tes antibodi spesifik virus) kanggo diagnosa lengkap kanggo nyegah diagnosis sing ora kejawab lan misdiagnosis.Yen asil tes ditemokake temenan ora konsisten karo manifestasi klinis, dianjurake kanggo nganakake analisis lengkap kabeh link tes (koleksi sampel, sirkulasi lan pranala pangolahan) kanggo ngilangi infeksi awal virus SARS-CoV-2, infeksi berulang utawa digabungake karo infeksi virus pernapasan liyane, lsp.Yen kahanan ngidini, dianjurake kanggo ngumpulake conto sing luwih sensitif kayata sputum utawa cairan lavage alveolar kanggo pemeriksaan maneh.

Produk sing gegandhengan:

Kit Deteksi Asam Nukleat SARS-CoV-2 (Metode Probe Fluorescent Multiplex PCR)