• PCR minangka cara sing digunakake kanggo nggedhekake DNA saka cithakan DNA cilik.RT-PCR nggunakake transkripsi mbalikke kanggo ngasilake cithakan DNA saka sumber RNA sing banjur bisa digedhekake.
• PCR lan RT-PCR biasane reaksi endpoint, nalika qPCR lan RT-qPCR nggunakake kinetika tingkat sintesis produk sajrone reaksi PCR kanggo ngitung jumlah cithakan saiki.
• Cara sing luwih anyar, kayata PCR digital, nyedhiyakake jumlah absolut saka cithakan DNA awal, dene cara kayata PCR isothermal nyuda kabutuhan peralatan sing larang kanggo menehi asil sing bisa dipercaya.

Polymerase chain reaction (PCR) minangka teknik biologi molekuler sing relatif prasaja lan akeh digunakake kanggo nggedhekake lan ndeteksi urutan DNA lan RNA.Dibandhingake karo cara tradisional kloning lan amplifikasi DNA, sing asring mbutuhake sawetara dina, PCR mung mbutuhake sawetara jam.PCR sensitif banget lan mbutuhake cithakan minimal kanggo deteksi lan amplifikasi urutan tartamtu.Cara PCR dhasar wis luwih maju saka deteksi DNA lan RNA sing prasaja.Ing ngisor iki, kita wis menehi ringkesan babagan macem-macem cara PCR lan reagen sing diwenehake ing Enzo Life Sciences kanggo kabutuhan riset sampeyan.Kita ngarahake mbantu para ilmuwan kanthi cepet ngakses reagen PCR kanggo digunakake ing proyek riset sabanjure!

PCR

Kanggo PCR standar, sing dibutuhake yaiku polimerase DNA, magnesium, nukleotida, primer, cithakan DNA sing bakal diamplifikasi, lan thermocycler.Mekanisme PCR prasaja kaya tujuane: 1) DNA untai ganda (dsDNA) didenaturasi panas, 2) primer sejajar karo untai DNA tunggal, lan 3) primer dilanjutake dening DNA polimerase, sing ngasilake rong salinan saka untaian DNA asli.Proses denaturasi, anil, lan elongasi sajrone sawetara suhu lan wektu dikenal minangka siji siklus amplifikasi (Gambar 1).

Saben langkah siklus kudu dioptimalake kanggo template lan set primer sing digunakake.Siklus iki diulang kira-kira 20-40 kaping, lan produk sing digedhekake banjur bisa dianalisis, biasane nganggo gel agarose (Gambar 2).

Amarga PCR minangka cara sing sensitif banget lan volume sing cilik banget dibutuhake kanggo reaksi tunggal, nyiyapake campuran master kanggo sawetara reaksi dianjurake.Campuran master kudu dicampur kanthi apik lan banjur dipérang miturut jumlah reaksi, mesthekake yen saben reaksi bakal ngemot enzim, dNTP, lan primer sing padha.Akeh supplier, kayata Enzo Life Sciences, uga nawakake campuran PCR sing wis ngemot kabeh kajaba primer lan cithakan DNA.

Wilayah sing sugih Guanine/Cytosine (kaya GC) minangka tantangan ing teknik PCR standar.Urutan sing sugih GC luwih stabil tinimbang urutan kanthi isi GC sing luwih murah.Salajengipun, urutan kaya GC cenderung mbentuk struktur sekunder, kayata puteran jepit rambut.Akibaté, untaian ganda sing sugih GC angel dipisahake kanthi lengkap sajrone fase denaturasi.Akibaté, DNA polimerase ora bisa sintesis untaian anyar tanpa alangan.Suhu denaturasi sing luwih dhuwur bisa nambah iki, lan pangaturan menyang suhu anil sing luwih dhuwur lan wektu anil sing luwih cendhek bisa nyegah ikatan primer sing sugih GC sing ora spesifik.Reagen tambahan bisa nambah amplifikasi urutan kaya GC.DMSO, gliserol, lan betaine mbantu ngganggu struktur sekunder sing disebabake interaksi GC lan kanthi mangkono nggampangake pamisahan untaian ganda.

Hot Start PCR

Amplifikasi sing ora spesifik minangka masalah sing bisa kedadeyan sajrone PCR.Umume polimerase DNA sing digunakake kanggo PCR paling apik ing suhu sekitar 68°C nganti 72°C.Enzim kasebut bisa uga aktif ing suhu sing luwih murah, sanajan ing tingkat sing luwih murah.Ing suhu sing adoh saka suhu anil, primer bisa ngiket non-spesifik lan mimpin kanggo amplifikasi non-spesifik, sanajan reaksi disetel ing es.Iki bisa dicegah kanthi nggunakake inhibitor polimerase sing dissociate saka polimerase DNA mung sawise suhu tartamtu wis tekan, mula istilah PCR wiwitan panas.Inhibitor bisa dadi antibodi sing ngiket polimerase lan denaturasi ing suhu denaturasi awal (biasane 95°C).

Polimerase High Fidelity

Nalika polimerase DNA nggedhekake kanthi akurat menyang urutan cithakan asli, kesalahan ing pencocokan nukleotida bisa kedadeyan.Kecocokan ing aplikasi kayata kloning bisa nyebabake transkrip sing dipotong, lan protein sing salah utawa ora aktif ing hilir.Kanggo ngindhari ketidakcocokan kasebut, polimerase kanthi aktivitas "proofreading" wis diidentifikasi lan digabung menyang alur kerja.Polimerase proofreading pisanan, Pfu, diidentifikasi ing taun 1991 ing Pyrococcus furiosus.Enzim Pfu iki nduweni aktivitas exonuclease 3' nganti 5'.Nalika DNA digedhekake, exonuclease mbusak nukleotida sing ora cocog ing ujung 3' untaian.Nukleotida sing bener banjur diganti, lan sintesis DNA terus.Identifikasi urutan nukleotida sing salah adhedhasar afinitas ikatan kanggo trifosfat nukleosida sing bener karo enzim, ing ngendi ikatan sing ora efisien nyebabake sintesis lan ngidini panggantos sing bener.Aktivitas proofreading polimerase Pfu nyebabake kesalahan ing urutan pungkasan dibandhingake karo polimerase DNA Taq.Ing taun-taun pungkasan, enzim proofreading liyane wis diidentifikasi, lan modifikasi enzim Pfu asli wis digawe kanggo luwih nyuda tingkat kesalahan sajrone amplifikasi DNA.

RT-PCR

Reverse transcription PCR, utawa RT-PCR, ngidini nggunakake RNA minangka cithakan.Langkah tambahan ngidini deteksi lan amplifikasi RNA.RNA ditranskripsi terbalik menjadi DNA komplementer (cDNA), menggunakan reverse transcriptase.Kualitas lan kemurnian cithakan RNA penting kanggo sukses RT-PCR.Langkah pisanan saka RT-PCR yaiku sintesis hibrida DNA/RNA.Reverse transcriptase uga nduweni fungsi RNase H, sing ngrusak bagean RNA saka hibrida.Molekul DNA untai siji banjur dirampungake dening aktivitas DNA polimerase DNA saka reverse transcriptase menyang cDNA.Efisiensi reaksi untaian pertama bisa mengaruhi proses amplifikasi.Saka kene, prosedur PCR standar digunakake kanggo nggedhekake cDNA.Kamungkinan kanggo mbalekake RNA menyang cDNA kanthi RT-PCR nduweni akeh kaluwihan, lan utamane digunakake kanggo analisis ekspresi gen.RNA iku siji-stranded lan banget ora stabil, kang ndadekake tantangan kanggo nggarap.Biasane dadi langkah pisanan ing qPCR, sing ngitung transkrip RNA ing sampel biologis.

qPCR lan RT-qPCR

PCR kuantitatif (qPCR) digunakake kanggo ndeteksi, menehi ciri lan ngitung asam nukleat kanggo macem-macem aplikasi.Ing RT-qPCR, transkrip RNA asring diukur kanthi transkripsi mbalikke menyang cDNA dhisik, kaya sing kasebut ing ndhuwur, lan banjur qPCR ditindakake.Kaya ing PCR standar, DNA diamplifikasi kanthi telung langkah sing diulang: denaturasi, anil, lan elongasi.Nanging, ing qPCR, label fluoresensi ngidini ngumpulake data nalika PCR maju.Teknik iki nduweni akeh keuntungan amarga macem-macem metode lan kimia sing kasedhiya.

Ing qPCR adhedhasar pewarna (biasane ijo), label fluoresensi ngidini kuantifikasi molekul DNA sing digedhekake kanthi nggunakake pewarna pengikat dsDNA.Sajrone saben siklus, fluoresensi diukur.Sinyal fluoresensi mundhak kanthi proporsional karo jumlah replikasi DNA.Mula, DNA diukur kanthi "wektu nyata" (Gambar 3).Kerugian qPCR adhedhasar pewarna yaiku mung siji target sing bisa diteliti sekaligus lan pewarna kasebut bakal ngiket ds-DNA sing ana ing sampel kasebut.

Ing qPCR basis probe, akeh target bisa dideteksi bebarengan ing saben sampel, nanging iki mbutuhake Optimization lan desain probe target-tartamtu (s) digunakake saliyane primers.Sawetara jinis desain probe kasedhiya, nanging jinis sing paling umum yaiku probe hidrolisis, sing nggabungake fluorophore lan quencher.Transfer energi resonansi fluoresensi (FRET) nyegah emisi fluorofor liwat quencher nalika probe isih utuh.Nanging, sajrone reaksi PCR, probe dihidrolisis sajrone ekstensi primer lan amplifikasi urutan spesifik sing diikat.Pecahan probe misahake fluorophore saka quencher lan nyebabake paningkatan fluoresensi gumantung amplifikasi (Gambar 4).Mangkono, sinyal fluoresensi saka reaksi qPCR adhedhasar probe sebanding karo jumlah urutan target probe sing ana ing sampel.Amarga qPCR basis probe luwih spesifik tinimbang qPCR adhedhasar pewarna, asring teknologi sing digunakake ing tes diagnostik basis qPCR.

Amplifikasi Isotermal

Teknik PCR sing kasebut ing ndhuwur mbutuhake peralatan thermocycling sing larang kanggo ngunggahake suhu ruangan kanthi akurat kanggo langkah denaturasi, anil, lan ekstensi.Sawetara teknik wis dikembangake sing ora mbutuhake piranti sing tepat lan bisa ditindakake ing adus banyu sing prasaja utawa malah ing sel sing disenengi.Teknik kasebut sacara kolektif disebut amplifikasi isotermal lan kerja adhedhasar amplifikasi eksponensial, linier, utawa kaskade.

Jenis amplifikasi isotermal sing paling misuwur yaiku amplifikasi isotermal loop-mediated, utawa LAMP.LAMP nggunakake amplifikasi eksponensial ing 65⁰C kanggo nggedhekake DNA utawa RNA cithakan.Nalika nindakake LAMP, papat nganti enem primer sing nglengkapi wilayah DNA target digunakake karo polimerase DNA kanggo sintesis DNA anyar.Loro primer iki nduweni urutan tambahan sing ngenali urutan ing primer liyane lan ngiket, ngidini struktur "loop" dibentuk ing DNA sing mentas disintesis sing banjur mbantu anil primer ing babak amplifikasi sabanjure.LAMP bisa digambarake kanthi macem-macem cara, kalebu fluoresensi, elektroforesis gel agarose, utawa kolorimetri.Gampang nggambarake lan ndeteksi anane utawa ora ana produk kanthi kolorimetri lan kekurangan peralatan sing larang nggawe LAMP dadi pilihan sing cocog kanggo tes SARS-CoV-2 ing wilayah sing ora kasedhiya tes laboratorium klinis, utawa panyimpenan lan transportasi conto. ora bisa ditindakake, utawa ing laboratorium sing sadurunge ora duwe peralatan thermocycling PCR.