Bahan wiwitan: RNA
Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) minangka metode eksperimen sing digunakake ing eksperimen PCR nggunakake RNA minangka bahan wiwitan.Ing metode iki, total RNA utawa messenger RNA (mRNA) pisanan ditranskripsi dadi DNA komplementer (cDNA) kanthi reverse transcriptase.Sabanjure, reaksi qPCR ditindakake nggunakake cDNA minangka cithakan.RT-qPCR wis digunakake ing macem-macem aplikasi biologi molekuler, kalebu analisis ekspresi gen, validasi interferensi RNA, validasi microarray, deteksi patogen, tes genetik, lan riset penyakit.
Cara siji-langkah lan loro-langkah kanggo RT-qPCR
RT-qPCR bisa ditindakake kanthi cara siji utawa rong langkah.RT-qPCR siji-langkah nggabungake transkripsi terbalik lan amplifikasi PCR, ngidini transkripase terbalik lan polimerase DNA kanggo ngrampungake reaksi ing tabung sing padha ing kondisi buffer sing padha.Siji-langkah RT-qPCR mung mbutuhake panggunaan primer khusus urutan.Ing rong langkah RT-qPCR, transkripsi mbalikke lan amplifikasi PCR ditindakake ing rong tabung, nggunakake buffer sing dioptimalake, kahanan reaksi, lan strategi desain primer.
| Kaluwihan | Kakurangan | |
| Siji Langkah | Cara iki nduweni kesalahan eksperimen sing kurang amarga loro reaksi ditindakake ing siji tabung
Langkah-langkah pipetting sing luwih sithik nyuda risiko kontaminasi
Cocog kanggo amplifikasi / screening high-throughput, cepet lan bisa direproduksi | Reaksi rong langkah ora bisa dioptimalake kanthi kapisah
Amarga kahanan reaksi dikompromi kanthi nggabungake reaksi rong langkah, sensitivitas ora apik kaya metode rong langkah.
Jumlah target sing dideteksi dening sampel siji cilik |
| Loro Langkah | Kemampuan kanggo nggawe perpustakaan cDNA stabil sing bisa disimpen kanggo wektu sing suwe lan digunakake ing pirang-pirang reaksi
Gen target lan gen referensi bisa digedhekake saka perpustakaan cDNA sing padha tanpa mbutuhake sawetara perpustakaan cDNA.
Buffer reaksi lan kahanan reaksi sing mbisakake optimalisasi reaksi tunggal
Pilihan fleksibel kondisi pemicu | Nggunakake pirang-pirang tabung, lan luwih akeh langkah pipetting nambah risiko kontaminasi DNA, lan wektu akeh.
Mbutuhake optimasi luwih akeh tinimbang metode siji-langkah |
produk sing gegandhengan:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Salah Langkah)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Salah Langkah)-Taqman
RT Easyᵀᴹ Aku Master Premix Kanggo Sintesis CDNA First-Strand
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Pemilihan total RNA lan mRNA
Nalika ngrancang eksperimen RT-qPCR, penting kanggo mutusake apa nggunakake RNA total utawa mRNA sing diresiki minangka cithakan kanggo transkripsi mbalikke.Sanajan mRNA bisa menehi sensitivitas sing rada dhuwur, RNA total isih kerep digunakake.Alesan kanggo iki yaiku total RNA nduweni kaluwihan sing luwih penting minangka bahan wiwitan tinimbang mRNA.Kaping pisanan, proses kasebut mbutuhake langkah-langkah pemurnian sing luwih sithik, sing njamin pemulihan cithakan kuantitatif sing luwih apik lan normalisasi asil kanggo miwiti nomer sel.Kapindho, ngindhari langkah pengayaan mRNA, sing bisa nyegah kemungkinan asil miring amarga beda pulih mRNA sing beda.Sakabèhé, amarga ing umume aplikasi, kuantifikasi relatif saka gen target luwih penting tinimbang sensitivitas mutlak deteksi, RNA total luwih cocok ing akeh kasus.
Primer transkripsi mbalikke
Ing metode rong langkah, telung cara beda bisa digunakake kanggo prime reaksi cDNA: primer oligo(dT), primer acak, utawa primer spesifik urutan.Biasane, primer oligo(dT) lan primer acak digunakake ing kombinasi.Primer iki anil menyang untaian mRNA cithakan lan menehi transcriptase mbalikke karo titik wiwitan kanggo sintesis.
| Pilihan primer | Struktur lan fungsi | Kaluwihan | Kakurangan |
| Oligo(dT) primer (utawa anchored oligo(dT) primer) | Anil lengkap kanggo residu timin ing buntut poli(A) mRNA;anchor oligo(dT) primer ngemot G, C, utawa A ing ujung 3′ (situs jangkar) | Sintesis cDNA lengkap saka mRNA buntut poli (A).
Ditrapake nalika kurang materi wiwitan kasedhiya
Situs jangkar mesthekake yen primer oligo(dT) ngiket karo 5′ poli(A) buntut mRNA. | Mung cocok kanggo amplifying gen karo poly(A) buntut
Entuk cDNA sing dipotong saka situs priming*2 ing poli(A)
Bias kanggo ngiket menyang mburi 3 '*
*Kamungkinan iki diminimalisir yen primer oligo(dT) anchored digunakake |
| primer acak
| Dawane 6 nganti 9 basa, sing bisa anil menyang pirang-pirang situs sajrone transkripsi RNA | Anneal kanggo kabeh RNA (tRNA, rRNA, lan mRNA)
Cocog kanggo transkrip kanthi struktur sekunder sing signifikan, utawa nalika kurang materi wiwitan kasedhiya
Ngasilake cDNA dhuwur | cDNA ditranskripsi mbalikke saka kabeh RNA, sing biasane ora dikarepake lan bisa ngencerake sinyal mRNA target.
njaluk cDNA truncated |
| primer spesifik urutan | Primer khusus nargetake urutan mRNA tartamtu | perpustakaan cDNA tartamtu
Ngapikake sensitivitas
Nggunakake primer qPCR mbalikke | Mung diwatesi kanggo sintesis gen target tunggal |
Reverse transcriptase
Reverse transcriptase minangka enzim sing nggunakake RNA kanggo sintesis DNA.Sawetara transkripase terbalik nduweni aktivitas RNase lan bisa ngrusak untaian RNA ing untaian hibrida RNA-DNA sawise transkripsi.Yen ora duwe aktivitas enzimatik RNase, RNaseH bisa ditambahake kanggo efisiensi qPCR sing luwih dhuwur.Enzim sing umum digunakake kalebu Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lan avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Kanggo RT-qPCR, luwih becik milih transkripase terbalik kanthi thermostabilitas sing luwih dhuwur, supaya sintesis cDNA bisa ditindakake ing suhu sing luwih dhuwur, njamin transkripsi RNA sing sukses kanthi struktur sekunder sing luwih dhuwur, nalika njaga aktivitas lengkap ing saindhenging reaksi, ngasilake cDNA sing luwih dhuwur.
produk sing gegandhengan:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
Aktivitas RNase H saka reverse transcriptase
RNaseH bisa ngrusak untaian RNA saka dupleks RNA-DNA, ngidini sintesis DNA untai ganda sing efisien.Nanging, nalika nggunakake mRNA dawa minangka cithakan, RNA bisa rusak prematur, nyebabake cDNA dipotong.Mulane, asring migunani kanggo nyilikake aktivitas RNaseH sajrone kloning cDNA yen sintesis transkrip dawa dikarepake.Ing kontras, transkripase mbalikke kanthi aktivitas RNase H asring migunani kanggo aplikasi qPCR amarga nambah leleh dupleks RNA-DNA sajrone siklus pertama PCR.
Desain dhasar
Primer PCR sing digunakake kanggo langkah qPCR ing RT-qPCR saenipun kudu dirancang kanggo span persimpangan ekson-ekson, ing ngendi primer amplifikasi bisa duweni potensi ngluwihi wates ekson-intron sing nyata.Wiwit urutan DNA genom sing ngemot intron ora digedhekake, desain iki nyuda risiko positif palsu sing digedhekake saka kontaminasi DNA genom.
Yen primer ora bisa dirancang kanggo misahake wates exon utawa exon-exon, bisa uga perlu kanggo nambani conto RNA karo RNase-free DNase I utawa dsDNase kanggo mbusak kontaminasi DNA genomik.
kontrol RT-qPCR
Kontrol negatif transkripsi mbalikke (kontrol -RT) kudu dilebokake ing kabeh eksperimen RT-qPCR kanggo ndeteksi kontaminasi DNA (kayata DNA genom utawa produk PCR saka reaksi sadurunge).Kontrol iki ngemot kabeh komponen reaksi kajaba reverse transcriptase.Wiwit transkripsi mbalikke ora kedadeyan karo kontrol iki, yen amplifikasi PCR diamati, kontaminasi saka DNA paling mungkin.
Wektu kirim: Aug-02-2022
