• facebook
  • linkedin
  • youtube

1. Ndeteksi absorbance saka solusi RNA

Penyerapan ing 280, 320, 230, lan 260 nm nggambarake nilai asam nukleat, latar mburi (kekeruhan larutan), konsentrasi uyah, lan bahan organik kayata protein.Umumé mung katon ing OD260 / OD280 (Rasio, R).Nalika 1.8 ~ 2.0, kita mikir yen kontaminasi protein utawa bahan organik liyane ing RNA bisa ditoleransi, nanging kudu dielingake yen Tris digunakake minangka buffer kanggo ndeteksi absorbansi, nilai R bisa luwih gedhe tinimbang 2 (umume kudu <2.2).Nalika R <1.8, polusi protein utawa bahan organik liyane ing solusi luwih jelas, lan nasib RNA bisa ditemtokake miturut kabutuhan.Nalika R>2.2, tegese RNA wis dihidrolisis dadi asam nukleat tunggal.
 
2. Pola elektroforesis RNA
Umume, gel denaturing digunakake kanggo elektroforesis RNA, nanging yen mung kanggo ndeteksi kualitas RNA, gel denaturing ora perlu, lan gel agarose biasa bisa digunakake.Tujuan elektroforesis yaiku kanggo ndeteksi integritas pita 28S lan 18S lan rasio, utawa integritas apusan mRNA.Umumé, yen pita 28S lan 18S padhang, cetha, lan cetha (ngarujuk marang pinggiran pita sing cetha), lan padhange 28S luwih saka kaping pindho saka pita 18S, kita nganggep kualitas RNA apik.
Ing ndhuwur minangka rong cara sing biasa kita gunakake, nanging ora ana rong cara kasebut kanthi jelas ngandhani manawa ana residu RNase ing solusi RNA.Yen ana jumlah RNase sing cilik banget ing solusi kasebut, angel kanggo kita ndeteksi kanthi cara ing ndhuwur, nanging umume reaksi enzimatik sabanjure ditindakake ing ndhuwur 37 derajat lan suwene suwe.Kanthi cara iki, yen ana jumlah RNase sing cilik banget ing solusi RNA, mula bakal ana lingkungan lan wektu sing cocog banget kanggo muter peran ing eksperimen sabanjure, lan mesthi eksperimen kasebut bakal adhem ing wektu iki.Ing ngisor iki kita ngenalake cara sing bisa ngonfirmasi manawa ana residu RNase ing solusi RNA.
 
3. Tes pengawetan panas
Miturut konsentrasi sampel, tarik loro 1000 ng RNA saka solusi RNA lan ditambahake menyang tabung centrifuge 0,5 ml, lan tambahan karo pH 7,0 Tris buffer kanggo volume total 10 ul, banjur segel tutup tabung.Sijine siji ing adus banyu suhu konstan ing 70 ° C lan tetep anget nganti 1 jam.Bagian liyane disimpen ing kulkas -20 ° C suwene 1 jam.Nalika wektu wis rampung, copot rong conto kanggo elektroforesis.Sawise elektroforesis rampung, mbandhingake pita elektroforesis saka loro kasebut.Yen pita loro kasebut konsisten utawa ora ana prabédan sing signifikan (mesthi, pita kasebut uga cocog karo kondisi ing cara 2), tegese ora ana kontaminasi residual RNase ing solusi RNA, lan kualitas RNA apik banget.Kosok baline, yen sampel sing diinkubasi ing 70 ° C nuduhake degradasi sing jelas, iki nuduhake yen ana kontaminasi RNase ing solusi RNA.
 
2 Metode lan teknik eksperimen kanggo ekstraksi RNA
Masalah sing kerep ditemoni nalika ngekstrak RNA yaiku: (1) ngasilake RNA kurang;(2) RNA duweni polusi uyah sing serius;(3) RNA nduweni polusi pelarut organik sing serius;(4) degradasi sampel lan masalah liyane
 
1. Reagen ekstraksi RNA total sing umum digunakake
Metode guanidine isothiocyanate lan metode Trizol minangka cara sing paling umum digunakake kanggo ekstraksi total RNA saka jaringan kewan lan sel kewan.Iku utamané cocok kanggo conto cilik lan jaringan sing utamané angel kanggo extract, kayata extraction saka total RNA saka kulit terwelu lan jaringan ikat kewan;Kajaba iku, Trizol, minangka reagen lisis tujuan umum, uga bisa digunakake kanggo ekstraksi jaringan tanduran, bakteri, jamur lan jaringan liyane.Kanggo jaringan tanduran sing ngandhut polisakarida lan polifenol, kayata camellia oleifera, godhong teh, rapeseed, lan liya-liyane, metode CTAB uga bisa digunakake kanggo ngekstrak total RNA.

Minangka cara konvensional, cara kolom pindho uga populer banget amarga operasi suhu normal, ora perlu nambah RNase, lan safety-ora ana kloroform, fenol lan reagen organik liyane kanggo ekstraksi.(produk dianjurake )

1
2

2. Ekstraksi total RNA saka jaringan kewan
 
(1) Coba milih tissue seger, yen ora seger (luwih apik ing telung sasi - 80 ℃ kulkas utawa beku ing nitrogen Cairan. Nalika nglereni tissue, ora Cut langsung ing suhu kamar, dadi manawa kanggo Sijine ing kothak es, nyoba supaya bola pembekuan lan thawing.
(2) Gunakake gunting lan pinset sing resik kanggo ngethok jaringan cilik, nyoba ngethok bagian tengah jaringan nalika nglereni sampel, utawa ngethok potongan gedhe saka tengah, banjur ngethok sampel ing posisi incision seger.Jaringan sing dibuwang kudu dipotong kanthi lengkap, dilebokake ing tabung EP tanpa RNase, nambah lysate, jaringan sing diiris kudu dilebokake ing lysate, lan nyiapake homogenisasi.

(3) Kanggo jaringan normal, pilih jaringan ukuran kacang ijo (30-60 mg) kanggo homogenisasi.Yen jaringan ngemot akeh protein, lemak, utawa jaringan fibrosa sing padhet kayata ati, tambah utawa nyuda jumlah jaringan sing dipotong (opsional) Pilih 10 ~ 20 mg).
(4) Yen otot iwak, daging udang, ubur-ubur lan jaringan liyane kanthi kandungan banyu dhuwur diekstraksi, volume sampel kudu ditambah kanthi tepat (dianjurake 100-200 mg).
(5) Yen kahanan ngidini, jaringan kewan bisa langsung diekstrak sawise dihomogenisasi nganggo homogenizer jaringan saluran dhuwur, yen ora ana peralatan kasebut.
(6) RNA sing dipikolehi sawise ekstraksi pungkasan kudu langsung diselehake ing kothak es kanggo nyuda degradasi RNA.

3. Ekstraksi RNA sel kewan

(1) Suspension sel: centrifuge langsung lan discard medium, wisuh karo PBS steril kanggo 1-2 kaping, banjur nundha karo jumlah cocok saka PBS, lan banjur nambah lysate kanggo lysis.Aja nambah lysate langsung menyang sel precipitated sawise rampung discarding Cairan.Iki bakal nimbulaké paket histone dirilis sawise sel lysed ing lapisan njaba kanggo tundhuk ing njaba sel precipitated, mangkono matesi kontak saka sel nang pelet karo lysate., nyebabake lisis sel sing ora lengkap lan nyuda ngasilake RNA.

(2) Sel sing semi-adherent utawa ora tightly adherent: Sawise discarding medium, wisuh karo PBS kanggo 1-2 kaping, banjur langsung nresep jumlah cocok saka PBS lan jotosan sajian budaya karo pipette utawa bedhil kanggo jotosan mati sel, lan pindhah menyang sel RNA-free.Tambah lysate menyang tabung EP enzim kanggo ekstraksi.

(3) Sèl adherent: kudu dicerna dhisik karo trypsin, banjur diklumpukake menyang tabung EP tanpa RNase, disentrifugasi kanggo mbusak supernatant, dicuci 1-2 kaping karo PBS kanggo mbusak keluwihan tripsin, lan disuspensi maneh kanthi jumlah PBS sing cocog Banjur nerusake menyang langkah ekstraksi.

4. Ekstraksi RNA tanduran

Jaringan tanduran sugih ing senyawa fenolik, utawa sugih polisakarida, utawa ngemot sawetara metabolit sekunder sing ora dingerteni, utawa duwe aktivitas RNase sing dhuwur.Zat kasebut digabungake kanthi rapet karo RNA sawise lisis sel kanggo mbentuk kompleks sing ora larut utawa endapan koloid, sing angel dibuwang.Mulane, nalika ngekstrak jaringan tanduran, kita kudu milih kit kanggo tanduran.Lysate ing kit kanthi efektif bisa ngatasi masalah oksidasi polifenol sing gampang lan pamisahan senyawa polisakarida lan asam nukleat.

(Kanggo ekstraksi RNA tanduran polysaccharide polyphenol, produk sing disaranake:

(1) Kulit, pulp, wiji, godhong, lan liya-liyane kudu digiling kanthi lengkap ing mortir.Sajrone proses mecah, nitrogen Cairan kudu diisi maneh ing wektu supaya sampel ora leleh.Sampel lemah kudu cepet ditambahake menyang lysate lan digoyang supaya ora rusak RNA.

(2) Kanggo conto sing sugih serat kayata godhong beras lan gandum, jumlah ekstraksi kudu dikurangi kanthi tepat, yen ora, mecah lan lisis jaringan ora bakal lengkap, nyebabake RNA sing diekstrak kurang.

(3) Kanggo jaringan tanduran kanthi kandungan banyu dhuwur, kayata woh delima, woh semangka, woh persik, lan liya-liyane, ukuran sampel kudu ditambah kanthi tepat (100-200 mg opsional).

(4) Jaringan tanduran, kayata godhong tanduran, rimpang, woh-wohan sing atos lan bahan-bahan liyane umume dianjurake nggunakake nitrogen cair kanggo nyampur bahan-bahan ing mortir, banjur nerusake menyang langkah ekstraksi.Penghomogen jaringan konvensional bisa uga ora efektif kanggo homogenisasi jaringan tanduran, lan umume ora dianjurake.

5. Pancegahan kanggo extraction RNA

(1) Sampel jaringan kudu seger sabisa kanggo nyegah pembekuan lan thawing bola-bali.

(2) Tisu kudu digiling kanthi lengkap sajrone ekstraksi, lan jumlah jaringan ora sithik, apamaneh akeh banget.

(3) Wektu inkubasi sing cukup kudu diwenehi sawise nambah lysate kanggo lyse sampel kanthi lengkap.

(4) Nalika nggunakake metode Trizol kanggo ekstraksi, prinsip nyerep supernatant sawise stratifikasi yaiku "luwih seneng nyedhot kurang saka inhale liyane", lan ora kudu diekstrak menyang lapisan tengah, yen ora bakal nyebabake kontaminasi DNA genomik sing serius.

(5) Nalika wisuh, Cairan ngumbah kudu kebak infiltrate sak tembok tabung kanggo mesthekake wisuh pepek.

(6) Kanggo cara extraction kolom, saliyane kanggo detaching kolom sawise ngumbah, kolom adsorption uga kudu diselehake ing bench Ultra-resik lan diunekake kanggo 5-10 menit kanggo kebak nguap pelarut organik kanggo dryness.

(7) Ing elusi pungkasan metode kolom, sawise nambahake banyu DEPC, kudu diinkubasi nganti 3-5 menit, utawa banyu DEPC kudu dipanasake nganti 60 ° C sadurunge kanggo nambah asil elusi.Ing cleavage Trizol tradisional lan cara udan isopropanol, RNA final dipun bibaraken ing banyu DEPC, supaya wektu cocok kudu diwenehi kanggo pembubaran, lan ngisor tabung centrifuge kudu terus-terusan diunekake karo tip pipette.

3 Three Panyebab lan solusi kanggo konsentrasi RNA kurang / kualitas kurang
 
1. Ngasilake kurang banget
Sampel sing diekstrak kurang banget, jumlah total ora cukup, utawa sampel sing diekstrak kakehan lan lisis ora lengkap;jaringan utawa sel saka kualitas cocok kudu digunakake kanggo extraction, pra-perawatan saka sampel kudu rampung uga, lan lysis kudu cukup.
 
2. Sisa génom
Nalika ngekstrak kanthi cara Trizol, nalika supernatant disedot menyang lapisan tengah sawise layering, kontaminasi genom serius bakal disebabake;perawatan ekstra kudu dijupuk nalika layering supaya ora ngisep menyang lapisan tengah.Yen metode kolom digunakake kanggo ekstraksi, kit sing ngemot DNase I bisa dipilih kanggo ekstraksi.Asam nukleat sing diserap ing membran langsung dicerna karo DNase I, sing bisa nyuda residu DNA.
 
3. Degradasi RNA
Bisa uga degradasi sampel sing diekstrak dhewe, utawa degradasi sing disebabake nalika proses ekstraksi;sabisa-bisa, conto seger kudu digunakake kanggo ekstraksi RNA, lan conto sing diklumpukake kudu disimpen ing nitrogen cair utawa -80 ° C kulkas ing wektu, lan pembekuan lan thawing bola-bali kudu nyingkiri.Tip gratis RNase/DNase, tabung centrifuge lan bahan liyane kudu digunakake ing proses ekstraksi RNA.Proses ekstraksi kudu cepet sabisa.RNA sing diekstrak kudu diselehake ing kothak es lan disimpen ing wektu -80.Yen RNA sing diekstrak kudu dideteksi kanthi elektroforesis gel, elektroforesis kudu ditindakake sanalika sawise ekstraksi, lan buffer elektroforesis kudu diganti karo sing mentas disiapake.
 
4. Uyah lan residu pelarut organik
Reagen ekstraksi ngandhut uyah fenol lan guanidine, lan larutan cuci ngandhut etanol.Sajrone proses ekstraksi, lysate ora diserap lan dibuwang, lan solusi cuci ora garing.Sisa uyah lan pelarut organik mbebayani kanggo transkripsi terbalik lan PCR sabanjure.Tingkat inhibisi sing beda-beda, saengga lysate jaringan kudu dibuwang kanthi lengkap sajrone proses ekstraksi, lan cuci kudu cukup supaya tembok ing saubengé tabung bisa dicuci.Kajaba iku, tabung dikosongake lan diunekake minangka langkah sing perlu, sing bakal nyuda residu bahan organik.
 
Kanggo informasi luwih lengkap babagan ekstraksi RNA, tututi situs web kita:
www.foreivd.com kanggo informasi luwih lengkap.

7

Wektu kirim: Dec-01-2022